世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養
Summary
人間の皮膚は外部環境に対する防御の最初の行として機能します。大人の皮膚から人間ケラチノ サイト主を分離する手法を提案します。これらの孤立したケラチノ サイトは、多数の実験のセットアップに便利、皮膚の生物学の in vitroの分子機構を研究するための非常に適してモデル
Abstract
ケラチノ サイトの主な機能は、それにより外の世界に機械的な障壁を維持する表皮の構造的な整合性を提供することです。加えて、ケラチノ サイトは、高速、非特異的に抗原刺激に応答する生得の免疫組織の部分であることによって開始、保守、および表皮の免疫応答の調節に重要な役割を再生します。ここで、成人の皮膚から人間ケラチノ サイト主の隔離のためのプロトコルを記述し、これらの細胞はカルシウム誘発性分化、分化マーカー involucrin の発現の増加によって測定されるように応答を示します。さらに、分離のケラチノ サイトが p38 MAPK 経路の活性化による細胞内シグナル伝達経路の IL 1 β による活性化に敏感であることを示します。一緒に取られて、分離、成人の皮膚からプライマリ ヒト角化培養するための方法について述べる。優勢な細胞型表皮ケラチノ サイトであるために、このメソッドは皮膚の生物学体外の分子メカニズムの研究に有用です。
Introduction
皮膚は人体の最大の臓器であり、外部環境に対する保護バリアとして機能します。皮膚は 2 つの主要な層で構成される: 真皮と表皮が皮膚の最外層を構成する表皮。表皮の最も豊富なセル型はケラチノ サイト細胞質量1,2の 95% 以上を構成します。ケラチノ サイトは、表皮の分化の各段階で維持され、分化3の特定の段階に対応する基底、棘、粒状、角質層に分類されます。ケラチノ サイトの主な機能は、それにより外の世界にそのままバリアを作り出す表皮の構造的な整合性を提供することです。
ケラチノ サイトも皮膚の病原体に対する防御の最初の行を表す、したがって自然免疫応答4,5で重要な役割を果たします。ケラチノ サイトの外部からの刺激への暴露は、サイトカイン、ケモカイン、および抗菌ペプチドを含む様々 な炎症性メディエーターの数の生産をその後、細胞内のシグナル伝達経路の活性化につながります。これら表皮細胞由来のタンパク質は募集し、特定の T 細胞6、7好中球、樹状細胞などの免疫細胞を活性化して炎症反応に参加します。したがって、ケラチノ サイトは、多数の生物学的プロセスに重要な役割を果たす、ので、ここで示した手法の背後にある理論的根拠は皮膚生物学を勉強するための in vitroモデルを生成します。新生児包皮から得られるプライマリ ケラチノ サイト培養皮膚生物学8,9の研究に使われます。ただし、ここで説明する手法に男女両方からケラチノ サイトは、細胞の高い生物学的多様性の結果取得されます。
ここでは、メンテナンスを含むとケラチノ サイトの凍結分離と大人の皮膚からプライマリ ヒト角化世代の詳細なプロトコルを提案します。このメソッドの全体的な目標は、 in vitro皮膚の生物学を研究するモデルとして使用することができますプライマリの人間ケラチノ サイトを生成することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、大人の皮膚から人間ケラチノ サイト主を簡単に分離する方法、およびそれらを体外培養する方法について述べる。このモデルは、表皮の細胞生物学の調査のための広範なアプリケーションを持つことができます、皮膚病の研究に興味を持って研究に便利することができます。
ここで説明したプロトコルの利点のいくつかは新生児の男性の割礼を受けて?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者が彼らのテクニカル サポートのアネット ・ ディスティニー ラスムッセンとクリスティン ・ メラーに深くお礼申し上げます
Materials
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | – |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | – |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | – | – | Forceps from any company can be used |
| Scissors | – | – | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | – | – | – |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | – | – | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | – |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | – |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
