يهدف هذا البروتوكول إلى تحقيق الهندسة السطحية من جزيرات البنكرياس باستخدام نانوكواتينج ستاربيج أدرجت الهيبارين عن طريق الكيمياء بيورثوجونال الزائفة بين مجموعات نانوكواتينج-هيدروكسيسوكسينيميدي نومجموعات أمين من جزيرة ليلى غشاء الخلية.
يمكن حماية الخلية السطحية هندسة الخلايا مزروع من المضيف محصنة ضد الهجوم. فإنه يمكن أيضا إعادة تشكيل المناظر الطبيعية الخلوية لتحسين وظيفة الاختلاس والبقاء على قيد الحياة بعد زرع الأعضاء. هذا البروتوكول يهدف إلى تحقيق الهندسة السطحية من جزيرات البنكرياس نانوكواتينج سامسونج ستاربيج أدرجت الهيبارين (Hep-شماعة) استخدام. لتوليد نانوكواتينج Hep-شماعة للهندسة السطحية جزيرة البنكرياس، تم تصنيعه الهيبارين سوكسينيميديل succinate (الهيبارين–دائرة الصحة الوطنية) أولاً قبل التعديل أفرقتها كاربوكسيلات استخدام N-(3-dimethylamino propyl)-ن ‘-إيثيل كاربودييميدي هيدروكلوريد (تنمية الصادرات) و N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS). ثم شكلت الخليط شماعة Hep crosslinking الأمينية فونكتيوناليزيد نهاية ثمانية مسلحين ستاربيج (ستاربيج-(NH2)8) والهيبارين–دائرة الصحة الوطنية. لطلاء السطح جزيرة ليلى، عزلت الجزيرات الماوس عبر كولاجيناز الهضم وتنقية التدرج باستخدام هيستوباك. ثم يعاملون الجزر المنعزلة مع الحل شماعة Hep الباردة الجليد لمدة 10 دقيقة للسماح الربط التساهمي بين دائرة الصحة الوطنية والمجموعات أمين من غشاء الخلية جزيرة ليلى. نانوكواتينج مع Hep-شماعة تتحمل تعديل الحد الأدنى لحجم جزيرة ليلى ووحدة التخزين وهيبارينيزيشن من الجزر مع شماعة Hep قد يقلل أيضا من لحظة رد فعل التهابات الدم بوساطة أثناء زرع جزيرة ليلى. هذا النهج “سهلة–إلى–اعتماد” معتدل ما يكفي للهندسة السطحية للخلايا الحية دون المساس بسلامة الخلية. وبالنظر إلى أن الهيبارين قد أظهرت تقارب ملزمة السيتوكينات متعددة، نانوكواتينج Hep-شماعة كما يوفر منصة مفتوحة تتيح إدماج الوسطاء البيولوجية الوظيفية غير محدود وأسطح متعددة الطبقات للمعيشة سطح الخلية الهندسة الحيوية.
محدود الفعالية العلاجية للعلاجات المستندة إلى الخلية باستبقاء خلية منخفضة وبقاء الفقراء1،2. من أجل تحسين نتائج العلاج خلية، والخلية الهندسة السطحية عن طريق التلاعب الانزيمية، تم تصريف الببتيد والكيمياء بيورثوجونال وتغليف المادية مع الحيوية المستغلة3،4، 5،6،،من78،،من910. البروتوكول الحالي يهدف إلى تحقيق الهندسة السطحية للخلايا الحية باستخدام أسلوب “سهلة–إلى–اعتماد” بتطبيق نانوكواتينج سامسونج ستاربيج أدرجت الهيبارين (الهيبارين-شماعة) سطح الخلية. هندسة السطح من جزيرات البنكرياس وعرضت هنا كمثال نظراً للطبيعة غير المتجانسة لجزر لانجرهانز وتحط نتائج زرع جزيرة السريرية الحالية.
وفي الواقع، زرع جزيرة السريرية تتم حاليا عن طريق الحقن المباشر للجزر الصغيرة المعزولة في الوريد البابي الكبدي وهذا الإجراء متوفر فقط للمرضى انتقائية بسبب ندرة المواد المانحة وانخفاض الفعالية العلاجية 11-تقليديا، كانت الجينات مادة بيولوجية الأكثر استخداماً لتغليف جزيرة ليلى وتعديل السطح، على الرغم من أنها أقل من مثالية بسبب عدم الاستقرار الكيميائي للجينات والمتصلة بالتهابات التليف12، 13. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع الحجم الطبيعي للجزر الصغيرة التي تتراوح ما بين 100 إلى 200 ميكرون، كبسولات رقيقة الجينات-جزيرة صغيرة جداً أكبر، تتراوح ما بين 400 و 800 ميكرون، التي تتجاوز المسافة نشرها الفسيولوجية للأوكسجين. تغليف جزيرة الامتثالي، أي.، تغليف الجزر دون تغيير كبير في حجم جزيرة ليلى، ووضعت بعد ذلك. وهكذا، ترسب نانوميمبرانيس تتألف من الوتد، تترافلورو، غشاء السيليكون أو نانوكواتينج متعدد الطبقات (يعرف أيضا باسم تقنية “طبقة بطبقة” [LBL]) أبلغ، الأمر الذي أدى إلى تحسن في المختبر بقاء جزيرة14 ،،من1516،،من1718، على الرغم من أن نهج LBL كثير من الأحيان يتطلب الجزيرات واسعة تسليم الفترة لترسب طبقات متعددة، مما قد يعرض للخطر بقاء جزيرة ليلى . وعلاوة على ذلك، تثير عدم استقرار نانوميمبرانيس التي تعتمد على التفاعلات الالكتروستاتيكي أو التساهمية بين طبقات بيوميمبراني أو التفاعلات مسعور بين نانوميمبرانيس وسطح جزيرة ليلى أيضا شواغل9،14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
عامل آخر يحد أن يرهن العلاجية نتيجة زرع جزيرة إينترابورتال هو لحظة الدم بوساطة التحريضية رد فعل (إيبمير) الناجمة عن الاتصال المباشر من الجزيرات مزروع بالدم، أسفر عن تراكم الصفائح الدموية، تخثر الدم ويضر المناعي أو التنشيط الخلوية غير مرغوب فيها9. لمعالجة هذه المشاكل، أعد نانوكواتينج رقيقة جداً تتكون من البولي إيثيلين على شكل نجمة غليكول (ستاربيج) للمنشأة توافق مع الحياة وبراعة كجزيرة الإسكان المواد. الهيبارين، جليكوسامينوجليكان نسبة عالية، وأدرج أيضا في نانوكواتينج ستاربيج لخصائصه المضادة للالتهابات، والمضادة تخثر والقدرة على تيسير الأوعية الدموية بتجنيد برو-الأوعية عوامل النمو22، 23.
في هذه المقالة، نظهر “سهلة–إلى–اعتماد” نهج للمعيشة سطح الخلية الهندسية نانوكواتينج ستاربيج أدرجت الهيبارين عن طريق الكيمياء بيورثوجونال الزائفة بين مجموعات نانوكواتينج-هيدروكسيسوكسينيميدي ن أمين جماعات من جزيرة ليلى البنكرياس الغشاء السطحي. والواقع أن المجموعات الأمينية داخل أغشية الخلية بشدة رد الفعل، ونتيجة لذلك أبلغت دراسات سابقة عن التفاعلات بين المجموعات الأمينية الأساسية مع N-هيدروكسيسوكسينيميديل (NHS) إستر المنشط تحت الظروف الفسيولوجية14 ،،من1621. وعلاوة على ذلك، أفادت بحوث مستفيضة أن إدماج الهيبارين، جليكوسامينوجليكان نسبة عالية وعنصرا هاما من عناصر المصفوفة خارج الخلية، أثناء تغليف جزيرة صغيرة، يمكن أن يؤدي إلى زرع بعد تعزيز عودة التوعي وانخفاض22،إيبمير23. نظراً لتوافق مع الحياة الوتد وخصائص متعددي الهيبارين، استخدمنا شماعة المسلحة 8 القصوى الهيبارين تحميل خلال تلفيق نانوكواتينج. تعديل الهيبارين مع–دائرة الصحة الوطنية، التي سترد فيما بعد مع المجموعات2 -NH على غشاء الخلية جزيرة ليلى. بتمكين تكوين رابطة تساهمية بين-NH2 (من غشاء الخلية) ودائرة الصحة الوطنية–Hep-شماعة، الجزر الصغيرة سوف تكون سهولة “مغلفة” الوتد أدرجت الهيبارين، وبالتالي تشكيل طبقة رقيقة نانو (نانوكواتينج) على السطح الخارجي للبنكرياس الجزر الصغيرة.
أن النهج الحالي يختلف عن أساليب سبق نشرها أيضا تحديده شماعة البوليمر الرئيسية لجزيرة ليلى الكبسلة المصغرة في أن كيمياء بيورثوجونال الزائفة بين دائرة الصحة الوطنية–(من نانوكواتينج) و-NH2 الخلية جزيرة ليلى وقد استخدم الغشاء. ونظرا لأن استقرار جزيرة ليلى/خلية الطلاء، لا سيما في بيئة معقدة مثل البلازما، أمر حاسم لزرع ما بعد عودة التوعي والبقاء على قيد الحياة، وتشكيل بين دائرة الصحة الوطنية–NH2 سيكون أكثر استقرارا بالمقارنة مع مسعور التفاعل بين الوتد وغشاء الخلية24، التفاعلات الالكتروستاتيكي9،15،24،،من2526 أو الصلة البيولوجية بين البيوتين ستريبتافيدين14.
وبالإضافة إلى ذلك، على النقيض من جزيرة ليلى طلاء نهج يعتمد على نهج LBL مع الفترة التعامل مع جزيرة ممتدة لترسيب طبقة متعددة14،16،25، هذا الأسلوب أيضا يتطلب الحد الأدنى فترة طلاء التجهيز وقصيرة جداً من الجزر المعزولة. كل هذه العوامل ضرورية للبقاء على قيد الحياة بعد زرع جزيرة ليلى نظراً لبقاء الجزر الصغيرة غالباً ما سبق عزلة جزيرة التالية الشبهة بسبب تلف ECM أثناء الهضم الأنزيمي. ومع ذلك، هو القيد واحد من النهج الحالي، خلافا LBL، عبر التي يمكن التحكم في سمك الطلاء الخارجي بزيادة أو خفض عدد ترسيب طبقة، لا تتناسب مع سمك نانوكواتينج Hep-شماعة في الوقت الحاضر.
وعلاوة على ذلك، سبب حالة خفيفة حيث قابلاً للتفاعل الكيميائي بين دائرة الصحة الوطنية–ويجري فيه2 -NH، النهج الحالي للخلية الحية سطح الهندسة لا تقتصر على جزيرات البنكرياس، ولكن معظم الخلايا العلاج. بالإضافة إلى ذلك، وبالنظر إلى أن الهيبارين هو معروف للتفاعل مع مجموعة من السيتوكينات وجزيئات نشطة بيولوجيا، نانوكواتينج Hep-شماعة يعرض أيضا منصة مفتوحة له إمكانية إدراج الوسطاء البيولوجية غير محدود، وكذلك واجهات للهندسة سطح الخلية أكثر تعقيداً.
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون للدعم المالي للصناديق العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (31770968) وبرنامج بحوث تيانجين لمؤسسة التطبيق والتكنولوجيا المتقدمة (17JCZDJC33400).
Reagent | |||
PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
Streptozototin | Sigma | S0130 | |
Histopaque | Sigma | 10831 | |
RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |