इस प्रोटोकॉल के लिए अग्नाशय के एक हेपरिन का उपयोग कर starPEG nanocoating शामिल की सतह इंजीनियरिंग प्राप्त करना है छद्म bioorthogonal रसायन विज्ञान के बीच-hydroxysuccinimide समूहों के एनnanocoating और टाप के अमीन समूहों के बीच कोशिका झिल्ली ।
सेल भूतल इंजीनियरिंग मेजबान प्रतिरक्षा हमले से प्रत्यारोपित कोशिकाओं की रक्षा कर सकते हैं । यह भी भ्रष्टाचार समारोह और अस्तित्व के बाद प्रत्यारोपण में सुधार करने के लिए सेलुलर परिदृश्य को फिर से आकार कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल के लिए एक ultrathin हेपरिन-शामिल starPEG (एेसी-खूंटी) nanocoating का उपयोग अग्नाशय के टाप की सतह इंजीनियरिंग प्राप्त करने के लिए करना है । अग्नाशय टाप भूतल इंजीनियरिंग के लिए एेसी-खूंटी nanocoating उत्पन्न करने के लिए, हेपरिन succinimidyl succinate (हेपरिन-एन एच एस) पहली बार n-(3-carboxylate dimethylamino)-nका उपयोग कर अपने propyl समूहों के संशोधन द्वारा संश्लेषित किया गया था-एथिल carbodiimide हाइडरोक्लॉराइड (EDC) और N-hydroxysuccinimide (एन एच एस) । इसके बाद एेसी-खूंटी मिश्रण से crosslinking का गठन किया गया जो अमीनों के अंतिम-कार्यात्मक आठ-सशस्त्र starPEG (starPEG-(NH2)8) और हेपरिन-एन. एस. आई. टाप सतह कोटिंग के लिए, माउस टाप collagenase पाचन और ढाल Histopaque का उपयोग कर शुद्धि के माध्यम से अलग थे । पृथक टाप तो 10 मिनट के लिए बर्फ ठंड एेसी-खूंटी समाधान के साथ इलाज किया गया आबंध एन एच एस और टाप सेल झिल्ली के अमीन समूहों के बीच बाध्यकारी अनुमति देते हैं । एेसी-खूंटी के साथ Nanocoating न्यूनतम घुमड़ कर टाप साइज और वॉल्यूम और heparinization के साथ साथ टाप की एेसी-खूंटी से टाप प्रत्यारोपण के दौरान तत्काल खून की मध्यस्थता वाली भड़काऊ प्रतिक्रिया भी कम हो सकती है । यह “आसान करने के लिए अपनाने” दृष्टिकोण सेल व्यवहार्यता समझौता किए बिना रहने वाले कोशिकाओं की सतह इंजीनियरिंग के लिए पर्याप्त हल्के है । यह देखते हुए कि हेपरिन एकाधिक साइटोकिंस के लिए बाध्यकारी संबंध दिखाया गया है, एेसी-खूंटी nanocoating भी एक खुला मंच है कि असीमित कार्यात्मक जैविक मध्यस्थों के शामिल होने और सेल सतह रहने के लिए बहु स्तरित सतहों प्रदान करता है bioengineering.
कोशिका-आधारित उपचारों की चिकित्सीय प्रभावकारिता कम सेल प्रतिधारण और गरीब अस्तित्व1,2द्वारा सीमित है । आदेश में सेल उपचार के परिणाम में सुधार करने के लिए, सेल भूतल इंजीनियरिंग via एंजाइमी हेरफेर, पेप्टाइड विकार, bioorthogonal रसायन विज्ञान और भौतिक encapsulation के साथ3,4शोषण किया गया है, 5,6,7,8,9,10. वर्तमान प्रोटोकॉल एक ultrathin हेपरिन-शामिल starPEG (हेपरिन-खूंटी) सेल सतह के लिए nanocoating लागू करने से एक “आसान-अपनाने” विधि का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं की सतह इंजीनियरिंग प्राप्त करने के लिए करना है । अग्नाशय के टाप की सतह इंजीनियरिंग आइलेट्स के टाप के विषम प्रकृति और वर्तमान नैदानिक टाप ट्रांसप्लांटेशन के दिखानेवाला परिणामों के कारण एक उदाहरण के रूप में यहाँ प्रस्तुत किया गया था.
दरअसल, नैदानिक टाप प्रत्यारोपण वर्तमान में यकृत पोर्टल नस में पृथक टाप के प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा किया जाता है और इस प्रक्रिया के कारण दाता सामग्री और कम चिकित्सकीय प्रभावकारिता की कमी के चुनिंदा रोगियों के लिए ही उपलब्ध है 11. परम्परागत रूप से, alginate को टाप encapsulation और सतह संशोधन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया गया जैव माल है, हालांकि यह alginate और भड़काऊ संबंधी फाइब्रोसिस12की रासायनिक अस्थिरता के कारण आदर्श से कम है, 13. इसके अलावा, टाप के प्राकृतिक आकार की तुलना में है कि १०० से २०० µm के बीच पर्वतमाला, alginate-टाप microcapsules बड़ा कर रहे हैं, ४०० और ८०० µm, जो ऑक्सीजन की शारीरिक प्रसार दूरी से अधिक के बीच लेकर । क्षेऽ टाप encapsulation यानी, टाप की मात्रा के महत्वपूर्ण परिवर्तन के बिना encapsulating टाप, फिर विकसित किया गया । इस प्रकार, खूंटी, tetrafluoroethylene, सिलिकॉन झिल्ली या बहु स्तरित nanocoating से बना nanomembranes का जमाव (भी “परत द्वारा परत के रूप में जाना” [LBL] तकनीक) की सूचना दी गई है, में सुधार के परिणामस्वरूप इन विट्रो टाप अस्तित्व14 ,15,16,17,18, हालांकि LBL दृष्टिकोण अक्सर व्यापक टाप एकाधिक परतों के जमाव के लिए अवधि सौंपने की आवश्यकता है, जो टाप व्यवहार्यता समझौता हो सकता है . इसके अलावा, nanomembranes की अस्थिरता है कि इलेक्ट्रोस्टैटिक या आबंध के बीच परस्पर झिल्ली परतों या hydrophobic बातचीत और nanomembranes और टाप सतह के बीच बातचीत पर निर्भर करता है भी चिंताओं उठाती9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
intraportal टाप ट्रांसप्लांटेशन के चिकित्सीय परिणाम encumbers एक और सीमित कारक है तत्काल रक्त मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया (IBMIR) रक्त के साथ प्रत्यारोपित टाप के सीधे संपर्क की वजह से, प्लेटलेट एकत्रीकरण में जिसके परिणामस्वरूप, जमावट और प्रतिकूल प्रतिरक्षा प्रभाव या अवांछित सेलुलर सक्रियण9. इन समस्याओं को हल करने के लिए, स्टार के आकार का पॉलीथीन ग्लाइकोल (starPEG) से बना एक अल्ट्रा-थिन nanocoating को टाप हाउसिंग सामग्री के रूप में अपनी स्थापित असंगति और बहुमुखी प्रतिभा के लिए तैयार किया गया था । हेपरिन, एक अत्यधिक sulphated glycosaminoglycan, इसके विरोधी भड़काऊ, विरोधी nanocoating गुण और प्रो-कौयगुलांट विकास कारकों की भर्ती द्वारा vascularization को सुविधाजनक बनाने की क्षमता के लिए starPEG angiogenic में शामिल किया गया था22, 23.
इस अनुच्छेद में, हम एक “आसान करने के लिए अपनाने” सेल सतह एक हेपरिन-hydroxysuccinimide के एनnanocoating समूहों के बीच छद्म bioorthogonal रसायन विज्ञान के माध्यम से starPEG nanocoating शामिल इंजीनियरिंग के लिए दृष्टिकोण और अग्नाशय टाप सतह झिल्ली के अमीन समूह । दरअसल, कोशिका झिल्ली के भीतर एमिनो समूहों अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हैं, और एक परिणाम के रूप में, पहले के अध्ययन के साथ प्राथमिक एमिनो समूहों के बीच बातचीत की सूचना दी है सक्रिय N-hydroxysuccinimidyl (एन एच एस) एस्टर शारीरिक शर्तों के तहत14 ,१६,२१. इसके अलावा, व्यापक अनुसंधान हेपरिन, एक उच्च sulphated glycosaminoglycan और extracellular मैट्रिक्स के महत्वपूर्ण घटक, टाप encapsulation के दौरान के निगमन, बढ़ाया के बाद प्रत्यारोपण के लिए नेतृत्व कर सकता है सूचित किया है revascularization और घटा IBMIR22,23. हेपरिन के खूंटी और multivalent गुणों की असंगति को ध्यान में रखते हुए, हम nanocoating के निर्माण के दौरान अधिक से अधिक हेपरिन लदान के लिए 8 सशस्त्र खूंटी का इस्तेमाल किया । हेपरिन-एन एच एस, जो बाद में टाप सेल झिल्ली पर एनएच2 समूहों के साथ प्रतिक्रिया होगी के साथ संशोधित किया गया था । के बीच आबंध बांड गठन को सक्षम करने से-NH2 (कोशिका झिल्ली के) और-एन एच एस की एेसी-खूंटी, टाप आसानी से होगा “लेपित” हेपरिन-शामिल खूंटी, इस प्रकार एक नैनो-पतली परत (nanocoating) बनाने के अग्नाशय की बाहरी सतह पर Islets.
वर्तमान दृष्टिकोण पहले प्रकाशित तरीकों से अलग है कि यह भी है कि छद्म के बीच में टाप microencapsulation के लिए प्रमुख बहुलक के रूप में खूंटी का चयन-एन एच एस (nanocoating के) और-bioorthogonal के एनएच2 झिल्ली का प्रयोग किया गया । इस तरह के प्लाज्मा के रूप में एक जटिल वातावरण में विशेष रूप से टाप/सेल कोटिंग की स्थिरता को ध्यान में रखते, के बाद प्रत्यारोपण revascularization और अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, के बीच गठन-एन एच एस और-एनएच2 की तुलना में अधिक स्थिर होगा hydrophobic खूंटी और सेल झिल्ली24, इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत9,15,24,25,26 या बायोटिन के बीच जैविक संबंध के बीच बातचीत streptavidin14.
इसके अलावा, इसके विपरीत में टाप कोटिंग दृष्टिकोण है कि बहु के लिए विस्तारित टाप हैंडलिंग अवधि के साथ LBL दृष्टिकोण पर निर्भर करता है परत जमाव14,16,25, वर्तमान तकनीक भी ंयूनतम की आवश्यकता है प्रसंस्करण और अलग टाप के बहुत कम कोटिंग अवधि । इन कारकों में से दोनों के बाद प्रत्यारोपण टाप अस्तित्व के लिए आवश्यक है के बाद से टाप व्यवहार्यता अक्सर पहले से ही एंजाइमी पाचन के दौरान क्षतिग्रस्त ECM के कारण टाप अलगाव के बाद समझौता किया है । हालांकि, वर्तमान दृष्टिकोण की एक सीमा है कि, LBL के विपरीत, जो बाहरी कोटिंग की मोटाई में वृद्धि या परत जमाव की संख्या को कम करने के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, एेसी-खूंटी nanocoating की मोटाई समय के लिए सिलवाया नहीं जा सकता है ।
इसके अलावा, हल्के हालत के कारण जहां के बीच रासायनिक प्रतिक्रिया-एन एच एस और-एनएच2 जगह लेता है, वर्तमान दृष्टिकोण कोशिका की सतह के लिए लागू है अग्नाशय के टाप तक सीमित नहीं इंजीनियरिंग, लेकिन सबसे सेल थेरेपी । इसके अतिरिक्त, यह देखते हुए कि हेपरिन साइटोकिंस और जैविक रूप से सक्रिय अणुओं की एक सीमा के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है, एेसी-खूंटी nanocoating भी एक खुला मंच है कि असीमित जैव मध्यस्थों के शामिल करने के लिए क्षमता है के रूप में अच्छी तरह से प्रस्तुत करता है अधिक जटिल सेल सतह इंजीनियरिंग के लिए इंटरफेस ।
The authors have nothing to disclose.
हम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान कोष (३१७७०९६८) और आवेदन फाउंडेशन और उंनत प्रौद्योगिकी (17JCZDJC33400) के तियानजिन अनुसंधान कार्यक्रम के वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं ।
Reagent | |||
PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
Streptozototin | Sigma | S0130 | |
Histopaque | Sigma | 10831 | |
RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |