Этот протокол направлен на достижение поверхности инженерных панкреатических островков, используя гепарин включены starPEG Нанопокрытия через псевдо bioorthogonal химия между N– оксисукцинимидного групп Нанопокрытия и Амин группами островок клеточной мембраны.
Поверхности клеточной инженерии можно защитить имплантированные клетки от принимающей иммунной атаки. Он также может изменить сотовой пейзаж для улучшения функции трансплантата и выживание после трансплантации. Этот протокол стремится достичь поверхности инженерных панкреатических островков, используя Нанопокрытия ультратонких гепарин включены starPEG (Hep-PEG). Для создания Hep-PEG Нанопокрытия для поджелудочной островок поверхности инженерии, гепарин succinimidyl сукцината (гепарин-NHS) был впервые синтезирован модификации карбоксилат групп с помощью N-(3-dimethylamino propyl) –N’-этил Карбодиимиды гидрохлорид (EDC) и N– оксисукцинимидного (NHS). Затем смесь Hep-PEG был сформирован сшивки амино конце функционализированных восемь вооруженных starPEG (starPEG-(NH2)8) и гепарин-NHS. Для покрытия поверхности островок, островки мыши были изолированы через пищеварение коллагеназы и градиента очистки с помощью Histopaque. Изолированные островки лечили то лед холодной Hep-PEG решение для 10 минут позволить ковалентных привязки между ГСЗ и Амин группами островок клеточной мембраны. Нанопокрытия с гепатитом-PEG несет минимальные изменения островок размер и объем и Гепаринизация островков с гепатитом-PEG может также уменьшить мгновенного крови опосредованной воспалительной реакции при трансплантации островковых. Этот подход «легкий к принять» достаточно мягкий, для поверхности техники живых клеток без ущерба для жизнеспособности клеток. Учитывая, что гепарин показал сродство к нескольким цитокинов, Hep-PEG Нанопокрытия также обеспечивает открытую платформу, которая позволяет включение неограниченное функциональных биологических посредников и многослойные поверхностей для жизни поверхности клетки Биоинженерия.
Терапевтическая эффективность терапии на базе ячеек ограничивается низкой ячейки хранения и бедными выживания1,2. Для того чтобы улучшить исход клеточной терапии, клеточная инженерия поверхности через ферментативные манипуляции, спряжение пептида, bioorthogonal химии и физической инкапсуляции с биоматериалов был эксплуатируются3,4, 5,6,,78,9,10. Текущий протокол стремится достичь поверхности инженерных живых клеток с использованием метода «легкий к принять», применяя Нанопокрытия ультратонких гепарин включены starPEG (гепарин PEG) на поверхности клеток. Поверхностная инженерия панкреатических островков был представлен здесь в качестве примера из-за неоднородного характера островков Лангерганса и пренебрежительных результаты текущих клинических островок пересадке.
Действительно в настоящее время клинических островок пересадке производится прямой впрыск изолированных островков в печеночной воротной вены и эта процедура доступна только для селективного пациентов, из-за нехватки донорских материалов и низкой терапевтической эффективности 11. условно, альгинат был наиболее часто используемых биоматериала для инкапсуляции островок и модификации поверхности, хотя это меньше идеал, из-за химической нестабильности альгината и воспалительных связанных с фиброзом12, 13. Кроме того по сравнению с естественный размер островков, который колеблется от 100 до 200 мкм, микрокапсулы островка альгината крупнее, колеблется от 400 до 800 микрон, которые превышают физиологические диффундирующих расстояние кислорода. Конформное островок инкапсуляции, т.е., инкапсулируя островков без существенного изменения объема островок, затем был разработан. Таким образом осаждения nanomembranes состоит из PEG, тетрафторэтилена, силиконовой мембраны или многослойный Нанопокрытия (также известный как «слой за слоем» [LBL] техника) было сообщено, обусловило улучшение в vitro выживания островок14 ,,1516,17,18, хотя LBL подход часто требует обширных островков передачи период для нанесения нескольких слоев, которые могут поставить под угрозу жизнеспособность островок . Кроме того нестабильность nanomembranes, которая опирается на электростатических или ковалентных взаимодействий между биомембранной слои или гидрофобных взаимодействий между nanomembranes и островок поверхности также вызывает обеспокоенность9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Другим сдерживающим фактором, что обременяет терапевтические результаты intraportal островок трансплантации является мгновенное крови опосредованной воспалительной реакции (IBMIR) вызванные прямого контакта имплантированных островков с кровью, что приводит к агрегации тромбоцитов, коагуляции и иммунных негативное или нежелательных Сотовый активации9. Для решения этих проблем, ультра-тонкий Нанопокрытия, состоящий из звездных полиэтиленгликоля (starPEG) был подготовлен для ее установленных биосовместимость и универсальность как островок, материал корпуса. Гепарин, высоко сульфатная Гликозаминогликан, также была включена в starPEG Нанопокрытия для его противовоспалительное, анти коагулянта свойства и способность содействовать васкуляризации, привлекая pro ангиогенных факторов роста22, 23.
В этой статье, мы демонстрируем «легкий к принять» подход к жизни инженерных гепарин включены starPEG Нанопокрытия через псевдо bioorthogonal химия между группами N– оксисукцинимидного Нанопокрытия поверхности клетки и аминов группы поджелудочной островок поверхности мембраны. Действительно амино группы внутри клеточной мембраны Высокореактивная, и в результате ранее проведенных исследований сообщили взаимодействий между первичными группами аминокислот с активированной N– hydroxysuccinimidyl (NHS) эфира в физиологических условиях14 ,16,21. Кроме того обширные исследования сообщили, что включение гепарина, высоко сульфатная Глюкозаминогликан и важных компонентов внеклеточного матрикса, во время островок инкапсуляции, может привести к активизации после трансплантации реваскуляризации и снижение IBMIR22,23. Учитывая биосовместимость PEG и разносторонним свойства гепарина мы использовали 8 вооруженных PEG для максимальной загрузки во время изготовления Нанопокрытия гепарина. Гепарин был изменен с -NHS, который впоследствии будет реагировать с группами2 -NH на островок клеточной мембраны. Включение формирования ковалентная связь между -NH2 (клеточной мембраны) и -NHS Hep-PEG, островки бы быть легко «покрытием», гепарин инкорпорейтид PEG, формируя таким образом нано тонкий слой (Нанопокрытия) на внешней поверхности поджелудочной железы островков.
Нынешний подход отличается от ранее опубликованные методы, которые также выбран КОЛЫШЕК в качестве основных полимер для микрокапсулирования островок в этом псевдо bioorthogonal химии между -NHS (всего Нанопокрытия) и2 -NH островковых клеток мембрана была использована. Учитывая, что стабильность островковых клеток покрытие, особенно в сложной среде, современными, важно, чтобы после трансплантации реваскуляризации и выживания, формирование между ГСЗ – и -NH2 будет более стабильной по сравнению с гидрофобные взаимодействия между PEG и клеточной мембраны24, электростатических взаимодействий9,15,24,,2526 или биологические связи между биотин стрептавидина14.
Кроме того в отличие от островка покрытие подход, опирающийся на LBL подход с расширенной островок обработки периодом для многослойных осаждения14,16,25, настоящий техника также требует минимальной обработка и очень короткий период покрытие изолированных островков. Оба эти фактора имеют важное значение для выживания после трансплантации островковых, так как островки жизнеспособность уже часто скомпрометировано следующий островок изоляции из-за поврежденных ECM во время ферментативного пищеварения. Однако одно ограничение нынешнего подхода является, что, в отличие от LBL, через который Толщина внешнего покрытия может контролироваться путем увеличения или уменьшения числа слоевого осаждения, толщина Hep-PEG Нанопокрытия нельзя быть приспособлены для в настоящее время.
Кроме того из-за мягкого состояния, где химической реакции между ГСЗ – и -NH2 занимает место, нынешний подход применяется для живых клеток поверхности, инженерные не ограничивается панкреатических островков, но большинство клеточной терапии. Кроме того, учитывая, что гепарин известен взаимодействовать с ряда цитокинов и биологически активных молекул, Hep-PEG Нанопокрытия также представляет открытую платформу, которая имеет потенциал для включения неограниченное биологических посредников, а также интерфейсы для более сложных клеточной поверхности инженерии.
The authors have nothing to disclose.
Мы признательны за финансовую поддержку фондов национального естественных наук Китая (31770968) и Тяньцзинь приложения Фонд исследований программы и передовых технологий (17JCZDJC33400).
Reagent | |||
PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
Streptozototin | Sigma | S0130 | |
Histopaque | Sigma | 10831 | |
RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |