Quantification de l’endogène auxine et cytokinine durant la Culture entre-nœud d’ipéca

Summary

Des pousses adventives peuvent être induites sur les segments internodales d’ipéca sans traitement phytohormone. Pour évaluer la dynamique phytohormone au cours de la formation de pousses adventives, nous avons mesuré endogène auxine et cytokinine dans des segments internodales par LC-MS/MS.

Abstract

La formation de pousses adventives est une technique importante pour la propagation des cultures d’importance économique et à la régénération de plantes transgéniques. Phytohormone traitement est nécessaire à l’induction des pousses adventives dans la plupart des espèces. Si des pousses adventives peuvent être induites sont déterminée par l’équilibre entre auxine et cytokinine (CK) niveaux. Beaucoup d’efforts va dans la détermination des concentrations optimales et des combinaisons de phytohormones dans chaque tissu utilisé comme explants et dans chacune des espèces végétales. Dans ipecac, toutefois, des pousses adventives peuvent être induites sur internodales segments dans le milieu de culture sans traitement phytohormone. Cela permet la plasticité inhérente d’ipéca pour la différenciation des cellules doit être évaluée. Pour induire des pousses adventives en ipecac, nous cultivées internodales segments à 24 ° C sous 15 µmol m⁻² s⁻¹ de lumière dans un cycle de sombre lumière/10 h de 14 h sur un milieu B5 sans phytohormone solidifié avec gomme Gellane 0,2 % pendant 5 semaines. Pour étudier la dynamique phytohormone au cours de la formation de pousses adventives, nous avons mesuré l’acide indole 3-acétique endogène et CKs dans les segments par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide LC-MS/MS. Cette méthode permet l’analyse de l’acide indole 3-acétique endogène et CKs niveaux de manière simple. Il peut être appliqué afin d’étudier la dynamique de l’auxine endogène et CK pendant l’organogenèse chez d’autres espèces végétales.

Introduction

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) a proposé le concept de « totipotence », par quelles plantes cellules peuvent diviser, différencier et régénérer des plantes entières même après leur différenciation préalable en types spécifiques de cellules de plantes matures¹. En culture de tissus, si la régénération des plantes peut être induite ou non dépend de la combinaison et la concentration des phytohormones exogènes appliquées dans le milieu de croissance. Skoog et Miller ont constaté que des pousses adventives peuvent être induites de tabac cals sur milieu de culture contenant un taux élevé de CKs d’auxines, tandis que des racines adventives pouvaient....

Protocol

Remarque : Ipéca (c. ipécacuanha) a été utilisée dans cette étude, car elle facilite l’analyse des phytohormones endogènes.

1. croissance Conditions d’induire des pousses adventives d’ipéca

1. Préparer un milieu B5 sans phytohormone ajusté à pH 5,7¹⁰et ajoutez la gomme Gellane 0,2 %. Stériliser à l’autoclave.
2. Verser 25 mL de milieu stérilisé dans une boîte de Petri stérile (90 × 20 mm).
3. Couper des segments internodales 8 mm de plantules d’ipéca utilisant un scalpel chirurgical avec une lame n ° 22 sur une plaque acrylique stérile et placer sur le support (Figur....

Results

À la 1^st semaine, aucun des pousses adventives n’avaient formé. À la 2^ème semaine, petites pousses sont apparus. À la 3^rd et 4^ème semaines, le nombre de pousses accru pour la plupart dans les régions apicales (I et II) (Figure 2A). À la 5^e semaine, le nombre de pousses était approximativement 7 en région I et 5 dans la région II (Figure 2B). .......

Discussion

Pour identifier la distribution des phytohormones impliqués dans l’organogenèse, c’est important d’utiliser des matières végétales dans lesquelles organogenèse peut être observé sur un milieu sans phytohormone, parce que quand les phytohormones sont appliqués exogène d’explants pour induire tiges ou racines, ils affectent l’explant entier, rendant difficile d’évaluer la plasticité inhérente des plantes dans la différenciation cellulaire et l’organogénèse. Des pousses adventives peuvent être induites sur milieux de cultur.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
[2H5]acide indole-3-acétique	Olchemlm Ltd	031 1531	Étalon interne pour LC-MS/MS[
2H5]trans-zéatine	Olchemlm Ltd	030 0301	Étalon interne pour LC-MS/MS
[2H5]riboside trans-zéatine	Olchemlm Ltd	030 0311	Étalon interne pour LC-MS/MS[
2H6]N6-isopentenyl adénine	Olchemlm Ltd	030 0161	Étalon interne pour LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adénosine	Olchemlm Ltd	030 0171	Étalon interne pour LC-MS/MS
indole-3-acétique Étalon	Wako	098 00181	Étalon pour LC-MS/MS
trans-zéatine	SIGMA-ALDRICH	Z0876 Étalon 5MG	pour LC-MS/MS
trans-zéatine riboside	Wako	262 01081	Étalon pour LC-MS/MS
N6-isopentenyle adénine	SIGMA-ALDRICH	D7674 Étalon 1G	pour LC-MS/MS
N6-isopentenyl adénosine	ACROS ORGANICS	22648 1000	étalon pour LC-MS/MS
acétonitrile hypergrade pour LC-MS LiChrosolv	MERCK	1.00029.1000	solvant pour LC-MS/MS
Eau pour chromatographie LiChrosolv	MERCK	1.15333.1000	solvant pour LC-MS/MS
HPLC	SHIMADZU	Prominence
MS	Sciex	3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 cc	Waters	WAT094225	cartouche colonne
Oasis MCX 30 mg/1 cc	Waters	186000252	cartouche colonne
à vis col	Waters	186002805
bleu, 12 x 32mm bouchon à vis et septum en PTFE/silicone	Waters
Acquity UPLC BEH C18, 2,1 x 100 mm	Waters	186002350	Colonne UPLC
Proshell 120 EC-C18, 2,1 x 50 mm	Agilent	699775-902	Colonne UPLC
Microscope numérique	Leica	DHS1000
TissueLyser II	QIAGEN	85300
Lame chirurgicale	Feather	No. 22
Manche de scalpel	Feather	No. 4
Savant SpeedVac/Piège à vapeur réfrigéré	Thermo Fisher Scientific	SPD111/RVT4104	concentrateur sous vide
Tobe en verre jetable (13x100 mm)	IWAKI	9832-1310
Boîte de Pétri stérile	INA OPTICA	I-90-20