Direkta neuronala omprogrammering genererar nervceller som upprätthåller en ålder av somatiska startcellen. Här beskriver vi en enda vektor-baserade metod för att generera inducerade nervceller från dermal fibroblaster från vuxen människa givare.
Inducerade nervceller (iNs), produkten av somatiska celler direkt omvandlas till nervceller, är ett sätt att få patientderiverade nervceller från vävnad som är lättillgängligt. Genom denna väg, kan mogna nervceller erhållas inom loppet av några veckor. Här, beskriver vi en enkel och snabb one-step protokoll för att erhålla iNs från dermal fibroblaster erhålls genom biopsi prov från vuxen mänskliga donatorer. Vi förklara varje steg av processen, inklusive underhåll av dermal fibroblaster, frysning förfarandet för att bygga upp ett lager av cellen, sådd av cellerna för omprogrammering, samt villkor som kultur under konverteringen. Dessutom beskriver vi utarbetandet av glas coverslips för elektrofysiologiska inspelningar, långsiktiga beläggning förutsättningar och fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). Vi visar också exempel på resultaten kan förväntas. Protokollet beskrivs här är lätt att utföra och kan härledas tillämpas på mänskliga fibroblaster från mänsklig hud biopsier från patienter med olika åldrar och olika diagnoser. Detta protokoll genererar en tillräcklig mängd av moduler som kan användas för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar, inklusive sjukdom modellering, drogkontroll och målet validering.
Utveckling av effektiva behandlingar för neurologiska sjukdomar har hämmats av begränsad tillgång till levande mänskliga hjärnceller att utföra mekanistiska studier och funktionella analyser. Om ett decennium sedan, denna situation radikalt med utvecklingen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) teknik1,2. Detta i kombination med en bättre förståelse av de neurala differentiering mekanismer som inträffar under normal mänsklig utveckling, har tillåtit för generering av definierade och varierande neuronala subtyper från patienten och sjukdomen specifika material. Med sådant material är det nu möjligt att studera intracellulära mekanismer bakom neurologiska sjukdomar och potentialen hos olika föreningar att lindra de patologiska funktioner3.
Medan iPSCs har varit revolutionerande inom neurovetenskap, är en stor nackdel av dessa celler att deras åldrande signatur raderas under processen omplanering så att föryngrad neuron inte behåller den sårbarhet som är associerad med åldrande4,5,6. Denna särskilda funktion av nervceller som produceras kan hamna kritiska för går igenom många aspekter av den intracellulära patogena cascade, särskilt när det gäller sjukdomar som ålderdomen är en viktig riskfaktor.
Direkt neurala omprogrammering är en teknik där en somatisk cell omvandlas direkt till en i utan att gå via en pluripotenta mellanliggande skede. Detta möjliggör snabb generering av mänskliga nervceller in vitro- som kan vara både patienten och sjukdomen specifika. En anmärkningsvärd egenskap hos direkt omprogrammering är att cellen givaren start år upprätthålls, och med det, dess sårbarhet för åldrande processer såsom ökad produktion av oxidativ stress4,7. Som ett resultat, iNs från patienter med neurologiska sjukdomar associerade med åldrande, såsom Alzheimers och Parkinsons sjukdom, lämpar sig väl för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar inklusive sjukdom modellering, drug screening analyser och toxikologiska studier .
Det huvudsakliga förbehållet som har hindrat iNs från patienter med neurodegenerativa sjukdomar som ofta används är att de inte är lätt att programmera, och detta blir ännu svårare med utbyggnad av fibroblaster. Som ett resultat, har generation av celler i kvantiteter som krävs för dessa typer av program inte uppnåtts fram till nyligen8. Vi har nu utvecklat en enkel metod att omprogrammera fibroblaster från givare oavsett ålder på ett mycket effektivt sätt. Denna metod kombinerar uttrycket påtvingad av de neuronala transkriptionsfaktorerna Ascl1 och Brn2 med en knockdown av repressor protein RE1-ljuddämpning Transkriptionfaktorn (resten) använder en enda vektor. Här beskriver vi de olika steg som leder till generation av iNs konverteras från huden fibroblaster biopsier från äldre donatorer.
Denna en-One-Step/one vektor omprogrammering metoden erbjuder ett effektivt sätt att få iNs från mänskliga vuxen fibroblaster. Mänskliga vuxen fibroblaster är normalt mycket svårare att covert än fostrets fibroblaster, med begränsade studier tidigare rapportering effektivitetsvinsterna av cirka 5-10%12,13. Med detta nya protokoll dock det möjligt att uppnå en neuronal avkastning (mätt som MAP2 + celler) av ungefärligt 50%8. Våra protokoll kan dessutom användas på dermal fibroblaster som har blivit överförda flera gånger utan att förlora effektivitet av konvertering. Hittills har vi använt celler anpassade upp till 14 gånger utan att upptäcka någon minskning av verkningsgraden. Dessutom finns det ingen skillnad i omprogrammering effektivitet i våra händer med fibroblaster från givare i ålder mellan 52 och 87. Se referens8för mer information om ålder och sjukdom i andra cellinjer som testade med denna konstruktion. Andra studier har också rapporterat någon skillnad i verkningsgrad med ett lentiviral-baserade och liten molekyl-förbättrade protokoll med givare mellan 0 och 89 år4. Konsekvent tillämpning med miRNA-baserade neuronala omprogrammering har dessutom rapporterats hos fibroblaster i alla åldrar, med givare mellan 0 och 86 år7. Genom denna väg, kan mogna nervceller erhållas i cirka 12-15 veckor in vitro- eller cirka 8 veckor efter transplantation in vivo8. Detta är en fördel eftersom det ger tillgång till både sjukdom och patienten specifika mänskliga iNs från vävnad som är lättillgängligt. Även om detta protokoll är effektiv, det kommer inte att producera en 100% neuronala avkastning, och som sådan ett reningssteg som använder FACS exempelvis krävs.
Det mest kritiska steget inom detta protokoll är viral transduction (protokoll avsnitt 4). Det är avgörande att virus titern är exakt, förutom att ha klädd ett korrekt antal aHDFs för konvertering. Rekommenderade titern för användning med detta protokoll är mellan 4 x 108 och 4 x 109. Använda en titer av något lägre än 1 x 108 skulle inte rekommenderas som att lägga stora mängder virus kommer att vara giftigt för cellerna. Dessutom som fibroblaster börjar covert ins kommer att de bli mer sköra och mottagliga för lyft. Det är viktigt att vara varsam när du byter media som inte att störa cellerna för mycket. Detta kan göras genom att ta bort vätskan långsamt med 1000 µL pipett. Slutligen, när plätering för omprogrammering (protokoll avsnitt 3) är det viktigt att säkerställa en hälsosam fibroblast befolkning innan du börjar ett experiment; Detta indikeras av en cellviabilitet av över 90% med trypan blå färgning. AHDFs bör alltid vara passaged innan den når 95% konfluens.
Om det finns märkbara celldöd innan viral transduktion, inte börjar konvertering: Dubbelkolla att cellviabiliteten är över 90% och att det fanns inga problem med beläggning av plattan. Det förväntas att ha en liten mängd celldöd efter viral transduktion, detta bör dock inte vara betydande. I detta fall bekräfta exakt sådd av 50.000 aHDFs per brunn och kolla virus titern. Om det finns märkbara inkonsekvens mellan brunnar under konverteringen, kontrollera först att varje brunn innehåller en lika stor mängd media och overt avdunstning sker inte vid kanterna (om nödvändigt extra media kan läggas till kanten brunnarna). Alternativt, kontrollera steg 4,4 och lämplig blandning för en homogen suspension när transducing. Det är viktigt att lägga till lentivirus till medium först, innan du lägger till detta i brunnar. Att direkt lägga till lentivirus i brunnar ökar brunn till brunn variabilitet och sannolikt också att vara giftigt för cellerna. Slutligen, Kontrollera alltid att mediet värms till 37 ° C innan du lägger till celler.
Detta protokoll innehåller valfria avsnitt för beläggning villkor för lång sikt kultur av iNs och FACS sortering för att öka neuronal renhet. För experiment vill undersöka funktionell karakterisering av iNs, har ett protokoll för beredning av glas coverslips för elektrofysiologi också tagits med. Konvertering protokollet här är inställd för användning med en 24-bra platta. om så önskas detta kan ändras till en 6 – 12, 48-, plattan med 96 brunnar eller flaskor. I detta fall justera alla volymer till ytan av plattan eller kolven utnyttjas.
Detta protokoll använder uttrycket påtvingad av Ascl1 och Brn2 i kombination med en resten knockdown alla förpackade i en enda vektor8 för att generera iNs av en pan-neuronala fenotyp. Generering av någon gliaceller subtyper med den här metoden har dock inte utvärderats. Denna metod skulle således behöva ändras för användning med andra omplanering faktorer att erhålla subtyp specifika nervceller. Direkta omprogrammering har tidigare visat möjligheten att generera motoriska nervceller, sensoriska nervceller, fotoreceptorer, striatum medellång taggig nervceller och dopaminerga nervceller10,14. Detta kommer att gynna när du undersöker neurologiska sjukdomar i vilka specifika neuronala subtyp påverkas prioriterat, till exempel Parkinsons sjukdom och dopaminerga neuron.
Tills helt nyligen, direkt neurala omplanering tekniken tillät inte för produktion av moduler i ett standardiserat och effektivt sätt — till en nivå som krävs för toxikologi och drug screening analyser i stor skala. Denna nya metod är mycket effektiv och kan användas på fibroblaster som har blivit överförda många gånger, så att det nu tar bort dessa begränsningar och öppnar upp för en lång rad studier, inte bara i en mänsklig neurala system, men också i ett system som kan vara patientens specifika. Enkelheten i denna metod återger i tekniken tillgänglig för alla grupper som vill utföra liknande studier in-house och lätt kan användas inte bara för storskaliga biomedicinska applikationer, såsom drogkontroll och toxikologiska analyser, men också att stödja uppgifter som härrör från djurmodeller och mänskliga besiktning vävnadsprover.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Marie Persson Vejgården för tekniskt bistånd. Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från stiftelsen New York Stem Cell, Europeiska forskningsrådet inom EU: s sjunde ramprogrammet: FP/2007-2013 Neuro Stem Cell reparation (nr 602278) och ERC bidragsavtalet ingen. 30971, Vetenskapsrådet (bidragsöverenskommelse 521-2012-5624, 2016-00873 och 70862601 / Bagadilico), svenska Parkinson Foundation (Parkinsonfonden) och den strategiskt forskningsområde vid Lunds universitet Multipark (tvärvetenskaplig forskning i Parkinsons sjukdom). Janelle Drouin-Ouellet stöds av en kanadensisk institut för hälsa forskning (CIHR) gemenskap (#358492), och Roger Barker stöds av en NIHR Biomedical Research Centre bidrag till de Universitetar av Cambridge/Addenbrooke’s Hospital. Malin Parmar är en New York Stem Cell Foundation Robertson utredare. Shelby Shrigley finansieras av Europeiska unionen programmet Horisont 2020 (H2020-behöriga myndigheters-ITN-2015) under Marie Skłodowska-Curie-nätverket för innovativ utbildning och Grant avtal nr 676408.
Cell Lines | |||
Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old male. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
Milli-Q Water | Millipore | ||
Basal medium – Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
Neural differentiation medium – NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
Reagents for Coatings | |||
Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
Cell dissociation agent – Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, – phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
Reagents for Glass Coverslips | |||
Autoclaved deionized water | |||
Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
Ethanol 95% | |||
Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
Reagents for Immunocytochemistry | |||
Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
Equipment | |||
T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 – 1,000 µL. | ||
Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
Parafilm M | VWR | ||
ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
Laminar flow hood | |||
Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
Orbital shaker | |||
Sonicator – Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |