Surveillance de cellule à cellule Transmission des agrégats de protéine Prion chez Drosophila Melanogaster

Résumé

Accumulation de preuves souscrit l’idée qu’agrégats de protéine pathogène est associée aux maladies neurodégénératives répartis entre les cellules ayant des propriétés prion. Nous décrivons ici une méthode qui permet la visualisation de cellule à cellule propagation des agrégats de type prion dans l’organisme modèle, Drosophila melanogaster.

Résumé

Agrégation des protéines est un élément central de la plupart des maladies neurodégénératives, y compris la sclérose latérale amyotrophique (SLA), maladie de Huntington (MH), la maladie d’Alzheimer (ma) et maladie de Parkinson (MP). Agrégats de protéines sont étroitement associées à la neuropathologie dans ces maladies, bien qu’on ne connaît pas le mécanisme exact par lequel agrégation de protéines aberrantes perturbe l’homéostasie cellulaire normale. Nouvelles données fort appuyer l’hypothèse qu’agrégats pathogènes en AD, PD, HD, et ALS ont beaucoup de similitudes aux prions, qui sont des protéines uniquement les agents infectieux responsables des encéphalopathies spongiformes transmissibles. Prions répliquent par la création de modèles la conversion des versions nativement plié de la même protéine, entraînant la propagation du phénotype agrégation. Comment prions et protéines de type prion dans AD, PD, HD et ALS déplacer d’une cellule à l’autre est actuellement un domaine de recherche intense. Ici, un modèle de Drosophila melanogaster qui permet une surveillance de transmission de prion-like, cellule-cellule des agrégats de la huntingtine mutante (Htt) associé à HD est décrite. Ce modèle tire parti des outils puissants pour manipuler l’expression du transgène dans de nombreux tissus différents de drosophile et utilise une protéine cytoplasmique fluorescent-étiquetées directement rapport à prions comme transfert de mutant Htt agrégats. Ce qui est important, l’approche que nous décrivons ici peut servir à identifier de nouveaux gènes et voies qui médient propagation d’agrégats de protéines entre diverses cellules types in vivo. Information obtenue grâce à ces études étendra la compréhension limitée des mécanismes pathogènes qui sous-tendent les maladies neurodégénératives et révéler de nouvelles possibilités d’intervention thérapeutique.

Introduction

L’hypothèse de prion stipule que l’agent infectieux responsable pour les encéphalopathies spongiformes transmissibles (p. ex., maladie de Creutzfeldt - Jakob chez les humains, la tremblante du mouton, maladie du dépérissement chronique chez les cerfs et de wapitis et « maladie de la vache folle » chez les bovins ) est uniquement composé de protéines et dépourvu d’acides nucléiques¹. Dans les maladies de prion, la protéine prion cellulaire (PrP^C) suppose un pli non indigènes, stable (PrP-^Sc) qui est hautement bêta feuille riche et peut se propager autonome en convertissant et recruter des molécules monomères de PrP....

Protocole

1. accouplement à médiation Gal4 et QF Htt Transgene Expression chez la drosophile

1. Recueillir ou générer transgéniques Drosophila melanogaster lignes contenant tissu-spécifique Gal4 ou QF « pilotes », ainsi que les lignes contenant le type sauvage ou mutant transgènes Htt en aval du Gal4-UAS³⁸ ou QF-QUAS³⁹. Veiller à ce que les protéines qui sont exprimés de ces transgènes sont soudés aux protéines fluorescentes ou épitope-tag pour permettre la différenciation des mutants et sauvage Htt transgène produits dans la même volée. Voir la Figure 1.
   Remarque : Nous ut....

Résultats

Les méthodes décrites ici produisent des données robustes témoignant de prion comme transfert des agrégats de protéine Htt de population d’une cellule à l’autre chez la mouche intacte CNS. Conversion de type sauvage Htt du diffus au ponctuée observe par fluorescence directe de cette protéine de fusion YFP glia bénéficiaire à la suite de HttQ91-mCherry expression dans donateurs Orn (A-C de laFigure 2et Figure 4

Discussion

Comme le nombre de patients souffrant de maladies neurodégénératives ne cesse d’augmenter, il y a un besoin urgent d’augmenter la compréhension de la pathogenèse moléculaire de ces maladies, afin que les meilleurs traitements peuvent être développées. Nous décrivons ici des méthodes qui permettent de surveiller la transmission de prion-comme des agrégats de protéine pathogène entre différents types de cellules dans l’organisme modèle, Drosophila melanogaster. Nous avons récemment utilisé cette méthode pour démon.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 10X, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	AM9625	Dilué à 1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes	Thomas Scientific	2904F24
20 % de paraformaldéhyde (PFA)	Microscopie électronique Sciences	15713-S
Sérum de chèvre normal (NGS), filtré	Lampire Biological Laboratories	7332500	Aliquote et congélation à la réception
Poulet anti-GFP	Aves Labs	GFP-1020	Utilisation à une dilution de 1:500
Lapin anti-DsRed	Clontech	632496	Utilisation à une dilution de 1:2000 ; peut reconnaître les protéines fluorescentes à base de DsRed (par exemple mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Souris anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Utilisation à une dilution de 1:100 ; marquera les structures pré-synaptiques actives dans tout le cerveau de la mouche
FITC anti-poulet	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	Utilisation à une dilution de 1:250
Alexa Fluor 568 anti-lapin	Life Technologies	A11011	Utilisation à une dilution de 1:250
Alexa Fluor 647 anticorps anti-souris	Life Technologies	A21235	Utilisation à dilution 1:250
Slowfade Gold Antifade Réactif	Life Technologies	S36936
Lames de microscope (25 x 75 x 1,0 mm)	Fisher Scientific	12-550-143
Verre de couverture (22 x 22 mm)	Globe Scientific	1404-15
Dumont Biology Grade Pinces, Style 3	Ted Pella	503	utiliser dans une main non dominante
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5	Ted Pella	505	utilisation dans la main dominante
Logiciel d’analyse d’images LAS X Logiciel
Imaris	Bitplane

à d’analyse d’images Leica