מדידת ודפורמביליות והטרוגניות תא אדום בדם על ידי Ektacytometry

Summary

כאן אנו מציגים טכניקות כדי למדוד ודפורמביליות תא אדום והטרוגניות התאית על ידי ektacytometry. טכניקות אלה חלים כללי חקירות תא אדום ודפורמביליות וחקירת ספציפי מחלות הדם מאופיין על ידי הנוכחות של כדוריות אדומות הנוקשה deformable במחזור, כגון האנמיה החרמשית.

Abstract

ודפורמביליות תא אדום ירד הוא מאפיין של מספר הפרעות. במקרים מסוימים, מידת ודפורמביליות פגום יכול לחזות חומרת המחלה או מופע של סיבוכים חמורים. שימושים Ektacytometry לייזר viscometry עקיפה כדי למדוד את ודפורמביליות של כדוריות דם אדומות או הגדלת גזירה או של הדרגה osmotic-ערך קבוע של גזירה יישומית. עם זאת, מדידות ודפורמביליות ישירה קשים לפרש כאשר מודדים את הדם heterogenous, אשר מאופיין על ידי הנוכחות של כדוריות אדומות הנוקשה deformable. זאת בשל חוסר היכולת של תאים נוקשה כדי ליישר כהלכה בתגובה גזירה ותוצאות תבנית עקיפה מעוותת בסימן ירידה מוגזמת ודפורמביליות נראית לעין. מדידה של מידת העיוות מספק חיווי הטרוגניות של אריתרוציטים בדם. ב האנמיה החרמשית, זה הוא מתואם עם האחוז של תאים נוקשה, אשר משקף את ריכוז המוגלובין והרכב המוגלובין אריתרוציטים. בנוסף מדידה ודפורמביליות, ektacytometry הדרגתיות osmotic מספק מידע אודות השבריריות osmotic ואת המצב הידרציה של אריתרוציטים. פרמטרים אלה משקפים גם את ההרכב המוגלובין של כדוריות דם אדומות מחולים חרמשית. Ektacytometry מודד ודפורמביליות בקרב אוכלוסיות של תאי דם אדומים, לא, לכן, לספק מידע על ודפורמביליות או תכונות מכניות של אריתרוציטים בודדים. בכל מקרה, המטרה אחת מהטכניקות שתוארו במסמך זה היא כדי לספק שיטה נוח ואמין למדידת ודפורמביליות והטרוגניות הסלולר של דם. טכניקות אלה עשוי להיות שימושי עבור ניטור שינויים הטמפורלי, כמו גם התקדמות המחלה והתגובה התערבות טיפולית בהפרעות מספר. האנמיה החרמשית הוא דוגמה אחת מאופיין היטב. הפרעות אפשריות אחרות איפה מדידות ודפורמביליות תא אדום ו/או הטרוגניות עניין כוללים אחסון הדם, סוכרת, הפלזמודיום זיהום, מחסור בברזל, את anemias המוליטית עקב פגמים ממברנה.

Introduction

Ektacytometry מספק מידה נוח של ודפורמביליות תא אדום בתגובה שינויים גזירה (נמדד בפסקל ומתגבר (פי אי)) או השעיית osmolality בינוני. הפרמטרים הרלוונטי של תא אדום ודפורמביליות כוללים מדד אלונגציה מרבית (EI מקסימום), מידת ודפורמביליות מקסימלית של תא אדום בתגובה הגדלת גזירה, גזירה ½ (הה ½), את מאמץ גזירה הדרוש להשגת מקסימלי חצי ודפורמביליות. ¹ osmotic ektacytometry מעבר צבע יש מספר פרמטרים אינפורמטיבי. אלה כוללים האינדקס התארכות מינימלי (EI דקות), מידת השטח לבנפח יחס את osmolality שבו היא מתרחשת (O דקות), אשר היא מידת השבריריות osmotic. EI ומקס את osmolality שבו היא מתרחשת (O (מקסימום EI)) לספק מידע על קרום התא וגמישות פני השטח. התארכות מקסימלי חצי בזרוע hypertonic של המילוי ההדרגתי osmotic מיוצג על ידי EI hyper. EI hyper osmolality שבו היא מתרחשת, O היפר, מספקים מידע על צמיגות תאיים של התא האדום הנקבע על-ידי ריכוז המוגלובין. ^{2 , 3} מדידה ודפורמביליות בדם heterogenous, זה מורכב על ידי העובדה כי תאים נוקשה, כמו במגל כדוריות דם אדומות, לא ליישר כהלכה עם הכיוון של זרימה כגון תאים deformable בתגובה הגדלת גזירה. במקום לייצר תמונת דיפרקציה אליפטית אופיינית, לייצר תאים נוקשה דפוס כדורית, כשהתוצאה היא תבנית עקיפה בצורת יהלום כאשר המצופים באליפסה המיוצר על ידי תאי deformable. ^{4 , 5 , 6} . התבנית כדורית הוכח כדי שיתאימו בלתי הפיך במגל תאים על-ידי ביצוע ektacytometry בשברים מבודד של תאים בעקבות צפיפות צנטריפוגה. ⁶ בחישוב מדד התארכות כוללת מדדים של שני הציר קצרים וארוכים של האליפסה; מעויין מייצרת ולכן ירידה ניכרת של התארכות על ידי הגדלת הרוחב של הציר קצר. ⁷ בעבר הוכח כי מידת העיוות תבנית עקיפה הוא מתואם עם האחוז של המוגלובין מגל (HbS) והן את אחוז במגל בתאי דם מחולים עם האנמיה החרמשית. ⁵ מידת העיוות תבנית עקיפה ניתן להשיג על ידי ניתוחים מתמטיים מורכבים. ⁸ זה ניתן להשיג על-ידי התאמת פתיחת הצמצם במצלמה-ektacytometer או את רמת האפור של התוכנה התאמה לשנות את גובה תבנית עקיפה. ⁵ . אולם, פרטים לגבי כיצד להתאים את רמת האפור אינם מוגדרים היטב ואינו הצמצם במצלמה נגיש על הדור האחרון של ektacytometer זמינים מסחרית. כדי לעקוף בעיות אלה, לרווח המצלמה נגיש בקלות יכול לשמש כדי להתאים תבנית עקיפה לגבהים. ⁹ בשיטה זו כדי להעריך הטרוגניות הסלולר, מידת העיוות תבנית עקיפה ישויך עם האחוז של עוברית המוגלובין בדם של חולים עם אנמיה מגל התא. ¹⁰ מספר פרמטרים osmotic ektacytometry הדרגתיות הן באופן דומה בקורלציה עם האחוז של העובר או אנמיה המוגלובין בדם מחולים עם האנמיה החרמשית. תבנית עקיפה עיוות מתאמים סביר משקפים את התרומה של המוגלובין הרכב אל אחוז נוקשה, שאינם deformable תאים. עניין נוסף, הפרופיל כולה osmotic ektacytometry הדרגתיות עובר שינויים biphasic התואמים אחוז תאים צפופים במחזור במהלך משברים חרמשית. ¹¹

Ektacytometry שימושית גם במחקר של מספר הפרעות אחרות. Osmotic ektacytometry הדרגתיות היא אבחון לטיפול בהפרעות קרום תא אדום בירושה, כמו ספרוציטוזיס תורשתי, elliptocytosis תורשתי pyropoikilocytosis תורשתי. ^{3 , 12 , 13 , 14} Decreased ודפורמביליות מתרחשת מחסור בברזל. ¹⁵ אפיון “הנגע אחסון” של דם העסיקה ektacytometry ומחקרים עתידיים חוקרים גם את טיב הנגע, התערבויות למניעת הקמתו במהלך האחסון של דם שהופקד וסביר להניח תועלת טכניקות המוצג כאן. ¹⁶ Decreased תא אדום ודפורמביליות יש גם היה בקורלציה עם מחלת microvascular בחולי סוכרת. ¹⁷ מחקרים שנעשו לאחרונה קישור היפרגליקמיה, ריכוזים ascorbate תא אדום ואת השבריריות osmotic מראים שגורמים אלה עשוי להיות חשוב בהתפתחות של מחלות microvascular. ¹⁸ Ektacytometry מחקרים נערכים כעת לחקור את השערה זו (Parrow ועל לוין, שלא פורסמו נתונים). דם הבמה מלריה זיהום הוא שדרת מעניין אחר של חקירות ודפורמביליות תא אדום. הסלולר ודפורמביליות של הפלזמודיום falciparum נגוע כדוריות דם אדומות יורדת באופן דרמטי במהלך 48 השעות של התבגרות תאיים של הטפיל משלב טבעת לשלב schizont. הראיות מראות כי זה ודפורמביליות ירד מתהפך על התבגרות של הטפיל. ההיפוך עולה בקנה אחד עם שחרורו של כדוריות אדומות נגוע למחזור. ירידה ודפורמביליות נחשב להיות מתווך על ידי חלבונים הפלזמודיום לקדם פחמיות של התא האדום. ¹⁹ מחקרים אלה מייצגים מדגם קטן של תנאים חשובים קלינית היכן ודפורמביליות כדוריות דם אדומות מדידה ופרמטרים הדרגתיות osmotic הרלוונטיים. קיימים מספר תחומי מחקר נוספים.

טכניקות חלופיות למדידת תא אדום ודפורמביליות כוללים מלקחיים אופטיים (ידוע גם בשם מלכודות לייזר) אשר השתמש המאפיינים הפיזיים של פוטונים כדי למתוח כדוריות אדומות בודד אחד או יותר. ²⁰ טכניקה זו יש את היתרון של מדידה את ודפורמביליות של אריתרוציטים יחיד, אבל קצת אי-ודאות בכיול כוח הפיק השתנות ניכר על פני לימודי ²¹ וניתן לניתוח נתונים עתירי עבודה אלא אם כן אוטומטי. ²² micropipette, אשר משתמשת לחץ שלילי האחות של כדוריות דם אדומות לתוך micropipette, שאיפה גם שימש כדי למדוד את ודפורמביליות של כדוריות אדומות. ^{7 , 23} מדידות מרובות, כגון הלחץ הנדרש לרוקן את התא האדום, אפשריות עם כל מדד הגדרת מאפיינים שונים של התא האדום. ²³ מיקרוסקופ כוח אטומי הוא טכניקה ברזולוציה גבוהה המודד ממברנה נוקשות על ידי לכימות סטיה קרן לייזר כמחוון הטיה זיז לאורך פני השטח של תא אדום. ²⁴ טכניקות אלה מספקים מידע אודות אריתרוציטים בודדים, לא להתאים בקלות למדוד שינויים באוכלוסיות של כדוריות דם אדומות, ו, באופן כללי, דורשים מומחיות טכנית ניכר.

הרצון לטעום הפרט והן על אוכלוסיות של תאים בו זמנית הוביל ההתקדמות אוטומציה, התפתחות מיקרופלואידיקה ושיטות מבוסס על מערך. כמו ektacytometry, rheoscopy מודד ודפורמביליות כפונקציה של גזירה אבל תמונות נרכשים ישירות באמצעות מיקרוסקופ. ²⁵ עבור ניתוחים דרך-הניח גבוה יותר, הדמיה תא אוטומטיות כבר מועסקים לייצר הפצות ודפורמביליות באמצעות rheoscope. ²⁶ הטרוגניות הסלולר ניתן לכמת בשיטה זו אם הנתונים מנושא בקרה בריאים זמינים. ²⁷ מיקרופלואידיקה טכניקות מאפשרים גם עבור ניתוחים דרך-הניח גבוהה של תאים בודדים; עיצובים מרובים באמצעות עיבודים של סינון,²⁸ תא המעבר מאבחנים,²⁹ אשר מודד את הזמן הנדרש עבור תזרים כדוריות דם אדומות דרך micropore חלופות למדוד את הלחץ הנדרש להובלה כדוריות דם אדומות למדי מאשר זמן ³⁰ פותחו. פלטפורמה אחרת לניתוח דרך-הניח גבוהה של תאים בודדים הוא השבב מערך microchamber תא בודד, אשר יש יתרון נוסף של התרת במורד הזרם מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית אפיון של התאים. ³¹ למרות כל אחת מהטכניקות הללו שעשוי להיות שימושי, וייתכן שהוא מעולה עבור יישומים מסוימים, היתרונות השוואתית של ektacytometry כולל רגישות, קלות שימוש, דיוק. ³² הדור האחרון של ektacytometers זמינים מסחרית גם מחזיקים צדדיות ניכר במספר של מבחני שניתן לבצע.

Protocol

כל הנבדקים במחקר זה נתן הסכמה בכתב בהתאם את הצהרת הלסינקי והפרוטוקולים מוסדות של בריאות מוסדיים סקירה ההנהלה הארצית אישרה. 1. הפעלת את ektacytometer לחבר את הצנרור מהפתרון ניקוי הפתרונות פוליוינילפירולידון (PVP) osmolar נמוך וגבוה. להיות זהירים כדי לחבר את הצינור osmolar 0 לפתרון osmolar…

Representative Results

הממצאים ektacytometry המתוארים בכתב יד זה יכול לשמש כדי למדוד תא אדום ודפורמביליות בכל מצב. תיאור סכמטי של הגדרת כללי של ektacytometer מוצג באיור1. אוכלוסיות הומוגניות של אריתרוציטים תיצור תבנית עקיפה אליפטית בתגובה הגדלת גזירה יכול לשמש כדי לחשב מדד התארכות כמוצג <str…

Discussion

טכניקות ektacytometry המתוארים הם פשוטים ואוטומטיים טוב, המבטיח תוצאות חוקיים וגם לשחזור. למרות זאת, קיימים כמה צעדים קריטיים. בקרת טמפרטורה נאותה של הדם חשוב. אחסון בטמפרטורת החדר במשך יותר מ 8 שעות עשוי להשפיע על SS ½ ערכים. ³⁴ Ensuring כי הטמפרטורה של המכונה הוא יציב ב 37 ° C חשוב גם, כמו צמ?…

Materials

LoRRca MaxSis standard version	Mechatronics	LORC109000
LoRRca MaxSis Osmoscan	Mechatronics	LORC109001
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm	Mechatronics	QRR030910
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm	Mechatronics	QRR030930
Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials	Mechatronics	QRR030901
X clean	Mechatronics	QRR010946
P1000	MilliporeSigma	Z646555
P200	MilliporeSigma	Z646547
P200 filter tips	MidSci	AV200-H
P1250 filter tips	MidSci	AV1250-H
Kimwipes	MidSci	8091
1.5 mL eppendorf tubes	MidSci	AVSS1700
15 mL conical vial	MidSci	C15R