Immunocytochemical विश्लेषण के लिए प्रसंस्कृत मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के Zika वायरस संक्रमण
Summary
यह आलेख विवरण विधियों कि संस्कृति में मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए उपयोग किया जाता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में उन्हें विभिन्न न्यूरॉन उपप्रकार और astrocytes में अंतर करने के लिए कैसे, Zika वायरस संक्रमण का अध्ययन करने के लिए तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के उपयोग पर एक जोर के साथ.
Abstract
मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम सेल एक अद्वितीय गैर आनुवंशिक रूप से संशोधित मॉडल मानव विकास तंत्रिका पर विभिंन उत्तेजनाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रणाली है । बल्कि एक पशु मॉडल या आनुवंशिक रूप से संशोधित प्रेरित pluripotent कोशिकाओं का उपयोग करें, मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को एक प्रभावी इन विट्रो प्रणाली उपचार के प्रभाव, स्क्रीन दवाओं, या व्यक्तिगत मतभेदों की जांच करने के लिए प्रदान करते हैं । यहां, हम सीरम मुक्त मीडिया के साथ संस्कृति में मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, विभिंन भड़काने प्रक्रियाओं के माध्यम से विभिंन ंयूरॉन उपप्रकार और astrocytes में अंतर करने के लिए, और फ्रीज और ठीक इन कोशिकाओं । इसके अलावा, हम Zika वायरस संक्रमण का अध्ययन करने के लिए मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करने की एक प्रक्रिया का वर्णन ।
Introduction
Zika वायरस (ZIKV) एक flavivirus या तो यौन संचारित है, या मच्छर वैक्टर एडीज aegypti और एडीज albopictus मच्छरों द्वारा । ZIKV हाल ही में एक गंभीर सार्वजनिक स्वास्थ्य के संचरण और संबद्ध स्नायविक लक्षण1की आसानी के कारण खतरे के रूप में पहचाना गया था । सबसे अधिक स्नायविक प्रभाव के विषय में से एक गर्भवती संक्रमित माताओं2,3करने के लिए पैदा भ्रूण में microcephaly के विकास है । Microcephaly एक neurodevelopmental विकार है जहां सिर भ्रूण विकास के दौरान और जंम के समय ठेठ आकार से छोटा है, परिधि से कम 2 मानक विचलन मतलब है4नीचे के साथ । छोटे सिर परिधि सामांयतः विकासात्मक देरी, बरामदगी, दृष्टि और सुनवाई हानि, और खिला कठिनाई के रूप में comorbidities की एक किस्म के साथ है ।
हाल के अध्ययनों से पशु मॉडल या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल का इस्तेमाल किया है neurodevelopment पर ZIKV संक्रमण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए,6,7,8। हालांकि इन अध्ययनों ZIKV के हमारे ज्ञान के लिए योगदान दिया है, विभिंन प्रजातियों के उपयोग या आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं को समय लेने और/या अतिरिक्त चर है कि तंत्रिका कोशिकाओं को विकसित करने पर ZIKV के प्रभाव को पाया मई जोड़ सकते है5, ६ , 7 , 8. हालांकि, hNSC संस्कृति, विशेष रूप से इस प्रोटोकॉल में वर्णित गैर अनुयाई neurosphere संस्कृति के साथ कठिनाई, यह है कि संस्कृति9संस्कृति का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के प्रति बहुत संवेदनशील है । मध्यम घटकों, या यहां तक कि संस्कृति पोत के भौतिक हैंडलिंग में कोई परिवर्तन,9कोशिकाओं से एक प्रतिक्रिया बटोरने के लिए पर्याप्त है । इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, हम एक इन विट्रो मानव भ्रूण मस्तिष्क व्युत्पंन तंत्रिका स्टेम सेल (hNSCs) संस्कृति mechanistically भ्रूण तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं पर ZIKV के प्रभाव से पूछताछ के लिए विकसित की है । हमारे विधि का प्रयोग, hNSCs स्पष्ट phenotypic परिवर्तन10के बिना ८० से अधिक मार्ग के लिए बनाए रखा गया था । इसके अलावा, ऐसे trisomy के रूप में गुणसूत्र परिवर्तन या तो कोई नहीं या ंयूनतम11थे । यह hNSC कल्चर एक नॉन-अनुयाई neurosphere कल्चर के रूप में बढ़ता है । neurospheres का एक लाभ यह है कि क्षेत्रों संस्कृति में एक अद्वितीय पर्यावरण आला है कि अधिक vivo में niches में दो आयामी संस्कृतियों9की तुलना में प्रतिबिंबित करता है बनाएं । इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ यह है कि कई प्रकार के सेल hNSC संस्कृति से प्राप्त किया जा सकता है, एक अंवेषक को सक्षम करने के लिए hNSC अस्तित्व और भेदभाव पर दिया चर के प्रभाव का निरीक्षण । इस प्रोटोकॉल के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास या रोग के बारे में यंत्रवत सवालों के जवाब देख व्यक्तियों के लिए लागू है । निंनलिखित प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक hNSC संस्कृति का विस्तार करने के लिए ZIKV के साथ संक्रमित है, और बाद में भेदभाव की प्रक्रिया पर संक्रमण के प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए hNSCs अंतर । यह भी लंबी अवधि के उपयोग के लिए hNSCs स्टोर करने के लिए तरीके शामिल हैं, और ंयूरॉंस के विभिंन प्रकार में hNSCs अंतर है कि ZIKV प्रेरित घाटे मस्तिष्क कुरूपता के लिए योगदान के आगे की जांच की अनुमति11। हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल के लिए ब्याज की भी है जैसे किसी भी पर्यावरणीय उत्तेजना के प्रभाव को समझने की मांग जांचकर्ताओं तंत्रिका स्टेम सेल अस्तित्व और भेदभाव पर संक्रमण या विषाक्त पदार्थों के रूप में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
संस्कृति और हेरफेर करने की क्षमता hNSCs एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि उच्च प्रवाह दवा स्क्रीनिंग10,11,12,14के लिए मानव रोग मॉडलिंग से प्रयोजनों की एक किस्म के लिए इस…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम जॉन एस डन फाउंडेशन और मानव संक्रमण और प्रतिरक्षा विश्वविद्यालय के टेक्सास चिकित्सा शाखा (P.W.) के लिए संस्थान से धन द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
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