Immunocytochemical 분석에 대 한 교양된 인간 태아 뇌 신경 줄기 세포의 Zika 바이러스 감염
Summary
이 문서는 문화, 다양 한 신경 하위와 이다, Zika 바이러스 감염 연구 신경 줄기 세포의 사용에 대 한 강조와 함께 그들을 차별화 하는 방법에 있는 인간적 인 태아 두뇌 신경 줄기 세포를 확장 하는 데 사용 되는 방법을 자세히 설명 합니다.
Abstract
인간의 태아 뇌 신경 줄기 세포는 인간의 발달 신경 생물학에 다양 한 자극의 영향 연구에 고유 비-유전자 변형된 모델 시스템입니다. 오히려 동물 모델 또는 유전자 변형된 유도 만능 세포를 사용 하 여, 보다 인간의 신경 줄기 세포 화면 약물 치료의 효과 검사 하거나 개별 차이 검사에 효과적인 체 외에 시스템을 제공 합니다. 여기, 우리 인간의 태아 뇌 신경 줄기 세포 세럼 무료 미디어, 다양 한 신경 하위 및 다른 못쓰게 절차를 통해 이다 그들을 차별화 하 고 고정 하 고 복구와 문화에서를 확장 하는 데 사용 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜 제공 이러한 세포입니다. 또한, Zika 바이러스 감염 연구를 인간의 태아 뇌 신경 줄기 세포를 사용 하 여 프로시저를 설명 합니다.
Introduction
Zika 바이러스 (ZIKV)는 성적으로, 또는 모기 벡터 Aedes aegypti , Aedes albopictus 모기에 의해 전송 flavivirus. ZIKV 전송의 용이성으로 인해 심각한 공중 보건 위협으로 최근 확인 됐다 고 신경 증상1제휴. 하나는 대부분의 감염 된 임산부2,3태어난 태아에 microcephaly의 개발은 신경 효과 관한. Microcephaly 머리가 일반 크기 보다 작은 태아 개발 중 그리고 출생 시, 평균4아래 2 표준 편차 보다 작은 원주와 neurodevelopmental 장애입니다. 작은 머리 둘레 comorbidities 발달 지연, 발작, 비전 및 청력 손실, 및 어려움 먹이 등의 다양 한 일반적으로 동반 됩니다.
최근 연구 동물 모델 또는 유도 만능 줄기 세포 neurodevelopment5,6,,78ZIKV 감염의 효과 연구 하는. 이러한 연구는 ZIKV, 다른 종류의 사용의 우리의 지식에 공헌 했다 또는 유전자 변형된 세포 시간이 소요 될 수 있습니다 또는에 ZIKV의 효과 혼동 수 있습니다 추가적인 변수를 추가 하는 동안5, 세포 신경 개발 6 , 7 , 그러나 8., hNSC 문화, 특히 비 점착 neurosphere 문화가이 프로토콜에서 설명 된 어려움은 문화 문화9를 수행 하는 데 사용 하는 방법에 아주 과민 하다. 중간 구성 요소, 또는 심지어 문화 선박의 물리적 처리에 어떤 변화 든 지 셀9에서 반응을 유도 충분 하다. 이러한 문제를 해결 하기 위해 우리는 생체 외에서 인간 태아 두뇌 파생 된 신경 줄기 세포 (hNSCs) 문화 mechanistically 태아 신경 줄기 세포에 ZIKV의 효과가 개발. 우리의 방법을 사용 하 여, hNSCs는 명백한 phenotypic 변경10없이 80 구절에 대 한 유지 되었다. 또한, trisomy 같은 염색체 변경 했다 없음 또는 최소한의11. 이 hNSC 문화 비 점착 neurosphere 문화로 자 랍니다. Neurospheres의 장점 중 하나는 구체 2 차원 문화9에 비해 vivo에서 틈새의 더 반사 이다 문화에 독특한 환경 틈새를 만들. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 그 여러 셀 형식 파생 될 수 있다 hNSC 문화에서 주어진된 변수 hNSC 생존 및 분화에 미치는 영향을 관찰 하는 탐정을 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 시스템 개발 또는 기능 장애에 관한 기계 질문 하고자 하는 개인에 게 적용 됩니다. 다음 프로토콜 위하여 ZIKV, 감염 후 감염 분화 과정에 미치는 영향을 관찰 하는 hNSCs hNSC 문화를 확장 하는 방법을 설명 합니다. 그것은 또한 장기 사용에 대 한 hNSCs를 저장 하 고 hNSCs ZIKV 유도 적자 뇌 기형11에 기여의 더 허용 하는 뉴런의 다양 한 유형으로 차별화 하는 방법을 포함 한다. 우리는이 프로토콜은 또한 감염이 나 신경 줄기 세포 생존 및 분화에 독 소 같은 어떤 환경 자극의 영향을 이해 하고자 하는 수 사관에 대 한 관심의 믿습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다양 한 용도로 높은 처리량 약10,11,,1214, 심사에 인간의 질병을 모델링에서 사용할 수 있는 중요 한 도구를 제공 하는 문화 및 hNSCs를 조작 하는 기능 15,,1617. 많은 질문에 어떻게 인간의 태아 두뇌 NSCs 등 해결 되어야 남아 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 존 S. 던 재단과 인간 감염 및 면역 텍사스 대학 의료 지점 (외무장관)의 연구소에서 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
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