Zika Virus infektion av odlade mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller för Immunocytochemical analys
Summary
Den här artikeln beskriver de metoder som används för att expandera mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller i kultur, liksom hur att skilja dem i olika neuronala subtyper och astrocyter, med betoning på användningen av neurala stamceller att studera Zika virusinfektion.
Abstract
Mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller är en unik icke genmodifierade modellsystem studera effekterna av olika stimuli på mänskliga utvecklingsmässiga neurobiologi. Snarare än använder en djurmodell eller genetiskt modifierade inducerade pluripotenta celler, ger mänskliga neurala stamceller en effektiv in vitro- system för att granska effekterna av behandlingar, skärmen droger, eller granska individuella skillnader. Här, tillhandahåller vi detaljerade protokollen för metoder som används för att utöka mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller i kultur med serumfritt media, att skilja dem i olika neuronala subtyper och astrocyter via olika priming förfaranden, och att frysa och återställa dessa celler. Dessutom beskriver vi ett förfarande att använda mänskliga fostrets hjärnan neurala stamceller för att studera Zika virusinfektion.
Introduction
Zikavirus (ZIKV) är ett flavivirus som överförs sexuellt, eller av mygga vektorer Aedes aegypti och Aedes albopictus myggor. ZIKV identifierades nyligen som en allvarlig folkhälsorisk på grund av dess användarvänlighet överföring och anslutna neurologiska symtom1. En av mest rörande neurologiska effekter är utvecklingen av mikrocefali hos foster född till gravida infekterade mödrar2,3. Mikrocefali är en störning i nervsystemets utveckling där huvudet är mindre än den typiska storleken under fosterutvecklingen och vid födseln, med omkretsen mindre än 2 standardavvikelser under medelvärdet4. Den mindre huvudomfång åtföljs ofta av en mängd sjukdomstillstånd såsom försenad, kramper, syn och hörselnedsättning och utfodring svårigheter.
Nyligen genomförda studier har använt djurmodeller eller inducerade pluripotenta stamceller att studera effekten av ZIKV infektion på neuroutvecklingssjukdomar5,6,7,8. Medan dessa studier har bidragit till vår kunskap om ZIKV, användning av olika arter eller genetiskt modifierade celler kan vara tidskrävande och/eller lägga till ytterligare variabler som kan blanda ihop effekten av ZIKV på celler utveckla neurala5, 6 , 7 , 8. svårigheten med hNSC kultur, särskilt icke-anhängare neurosphere kulturen beskrivs i detta protokoll, är dock att kulturen är mycket känsliga för de metoder som används för att genomföra kultur9. Någon förändring i medelstora komponenter, eller ens den fysiska hanteringen av kultur fartyget, är tillräckligt för att framkalla en reaktion från celler9. För att lösa problemen, utvecklat vi en in vitro- mänskliga fostrets hjärna-derived neurala stamceller (hNSCs) kultur för att slentrianmässigt förhöra effekten av ZIKV på fostrets neurala stamceller. Med vår metod, bibehölls hNSCs för över 80 passager utan uppenbar fenotypiska förändringar10. Dessutom kromosomala förändringar såsom trisomi var antingen ingen eller minimal11. Denna hNSC kultur växer som en icke-anhängare neurosphere kultur. En fördel med neurospheres är att kulorna skapar en unik miljö nisch i kultur som är mer reflekterande i vivo nischer jämfört med tvådimensionell kulturer9. En annan fördel med detta protokoll är att flera celltyper kan härledas från den hNSC kulturen, så att en utredare att iaktta effekterna av en viss variabel på hNSC överlevnad och differentiering. Detta protokoll är tillämpligt för individer som söker för att besvara mekanistiska frågor angående centrala nervsystemet utveckling eller dysfunktion. Följande protokoll beskriver hur att utöka en hNSC kultur för att infektera med ZIKV, och därefter skilja hNSCs för att observera effekterna av infektion på differentiering processen. Den innehåller också metoder för att lagra hNSCs för långsiktig användning, och differentieras hNSCs till olika typer av nervceller som tillåter att ytterligare utredning av ZIKV-inducerad underskott bidrar till hjärna missbildning11. Vi anser att detta protokoll är också av intresse att utredarna försöker förstå effekten av eventuella miljömässiga stimulus såsom infektion eller toxiner på neurala stamceller överlevnad och differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Möjligheten att kultur och manipulera hNSCs ger ett kritiskt verktyg som kan användas för olika ändamål från modellering mänskliga sjukdomar till hög genomströmning drug screening10,11,12,14, 15,16,17. Många frågor återstod att ta itu med såsom hur mänskliga fostrets hjärnan …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av medel från John S. Dunn Foundation och Institutet för mänskliga infektioner och immunitet på University of Texas Medical Branch (PW).
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. . All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission – Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. . Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
