Bu iletişim kuralı, Yenidoğan fare veya erken insan bağırsak yanı sıra fareler süt toplamak için verimli bir yöntem bir enteroid kültür sistemi kurmak açıklar.
İnsan küçük bağırsak enteroids kriptalarının türetilmiştir ve kök hücre niş içinde yetiştirilen epitel hücre türlerinin tümünü içerir. İnsan enteroid ex vivo kültür sistemleri kurmak için yetenek modeli bağırsak patofizyolojisi ve belirli hücresel yanıt dahil çalışma gerekir. Son yıllarda, enteroids fareler ve insanlar, pasajlı ve banked uzakta birkaç laboratuarlarında ileride kullanmak için dünya çapında kültürlü. Bu enteroid platformu çeşitli tedaviler ve ilaçlar etkilerini ve farklı hücre tipleri bağırsak üzerinde ne gibi etkileri sarf test etmek için kullanılabilir. Burada, birincil kök hücre kaynaklı küçük bağırsak enteroids kurmak için bir protokol yenidoğan fareler türetilen ve erken insan bağırsak sağlanır. Ayrıca, bu enteroid kültür sistemi species-specific anne sütü etkilerini test etmek için kullanılmıştır. Fare anne sütü verimli bir şekilde değiştirilmiş insan göğüs pompası kullanılarak elde edilebilir ve ifade fare süt o zaman daha fazla araştırma deneyler için kullanılabilir. Biz şimdi ifade fare, insan, etkileri göstermek ve neonatal fareler veya erken insan ince bağırsak donör anne sütü büyüme ve enteroids yayılması türetilmiş.
Enterokolit Nekroze edici (NEC) gastrointestinal hastalığı etkileyen yaklaşık 28 hafta gebelik1,2,3önce tarihi 1 10 bebeklerde prematüre bebeklerde ölüm önde gelen nedenidir. Yarısı, bebeklerin hayatta kalma sadece % 10-304,5nerede en ağır formu için NEC ilerleme ile. Amerika Birleşik Devletleri’nde bir tahmini 2-3 milyar YTL/yıl harcanan bebekler NEC6,7ile tedavi henüz ne sağkalım oranı ne de terapi son 30 yıl içinde değişti. NEC patogenezinde bağırsak yaralanma ile karakterizedir ve Mukozal iyileşme8,9,10,11, ancak, bir yaygınlaşacak önde gelen sinyal yolları Engelli inflamatuar yanıt ve inflamasyonu tersine çevirmek için mekanizmaları tam olarak anlaşılır kalır.
İnsan anne sütü yönetim prematüre bebekler için NEC karşı strateji sadece koruyucu olduğu tespit edilmiştir. Biz daha önce anne sütü NEC geliştirme yolu ile yolu11sinyal epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) bağırsak epitel içinde doğuştan gelen bağışıklık reseptör toll benzeri reseptör 4 (TLR4) inhibisyonu yoluyla karşı korur göstermiştir. Anne sütü deneysel bir NEC Formula takviyesi Enterocytes apoptosis inhibisyonu ve restorasyon epidermal büyüme üzerinde bağımlı bir şekilde Enterocytes yayılması tarafından gösterildiği gibi NEC görüldüğü inflamatuar yanıt zayıflatılmış faktör (EGF) ve EGFR11. Başka bir çalışmada, o göstermek bu nitrat, başka bir bileşeni olan anne sütü, koruyucu doğası ile karşılaştırıldığında hangi NEC yüksek frekans için katkıda bulunabilir ve nitrat eksik bebek formülü, bağırsak perfüzyon oransal tarafından katkıda bulunur formülü bebeklerin12,13beslenir. İnsan sütü oligosakkaritler, L-Arginin, glutamin ve Laktoferrin14,15,16, anne sütü mevcut NEC karşı koruma dahil olmak için gösterilen diğer bileşikler içeren 17,18,19. Anne sütü yararlı bu unsurları NEC önlenmesinde kullanımı gerekliliği ortaya, ama aynı zamanda yollar ve hücresel etkileri anne sütü NEC karşı koruma arabuluculuk nasıl içinde ilgili sinyal mekanizmaları, eğitim önemini vurgulamak .
İleri çalışmalar amacıyla anne sütü, NEC, fare modeli koruyucu özelliklerini biz hangi fare tarafından anne sütü bir elektrik insan meme pompası11,12 kullanarak bir imzalat Barajı elde edilebilir bir roman, kullanımı kolay tekniği gelişmiş . Fare anne sütü edinme Bu strateji değil bu yöntem species-specific meme süt analizleri için verdiğinden yalnızca insan göğüs pompaları ama aynı zamanda hazır ve anne sütü, tedarik verimli olduğundan avantajlıdır. Sonuç olarak, biz fare anne sütü etkileri bu insan sütünü ile karşılaştırabilirsiniz yanı sıra species-specific modelleri süt bankada insan donör süt pastörize. Meme süt bileşenleri ile ilgili olarak yaptıkları katkı NEC önleme yolunda çalışması için bu teknik sağlar. Diğer araştırmacılar meme süt çıkarma yöntemleri geliştirdik, ancak, bu teknikleri el ile ve genellikle birden fazla laboratuvar üye20,21,22gerektirir. Burada bir fareden süt toplamak için bir insan elektrikli göğüs pompası değiştirerek kullanılabilir bir basit tekniği sunulur. Bu teknik diğer türler için de uygulanabilir.
Yeterli sinyal yolları NEC ile ilgili sorguya çekmek için model sistemleri tüm hastalık sürecinde etkilendiği bilinen farklı hücre türleri değerlendirmek için ihtiyaç vardır. Burada, bir tür modeli sistemi – enteroids – ve kendi kuruluş fare ve insan ince bağırsak tartışmak. Gastrointestinal sistem gerçekleşecek patofizyolojik süreçlerin çalışmada yardım etmek için bir yenilikçi, genetik olarak farklı ex vivo insan modeli sundukları çünkü insan bağırsak enteroids (HIEs) özellikle önemli söz, sağlamak 23. Enteroids uzun vadeli kültürlü tespit edilmiştir ve daha sonra kullanım23için dondurulmuş ve insan bağırsak olan kültürler indüklenebilir pluripotent kök hücrelerden gelişmiştir, Organoids farklı olarak (HIOs), kök hücrelerden enteroids oluşturulur izole bağırsak kriptalarının24içinde. Enteroids daha az bakım gerektiren, olabilir hızlı bir şekilde25enfekte ve bağırsak kriptalarının daha HIOs23farklılaşmış beri kolayca kurulabilir. Bu nedenle, insan gastrointestinal epitel23bölgeye özel kompozisyon ve fonksiyonel özellikleri sergilemek geliştirilebilir çünkü HIEs mevcut teknikleri birçok avantajlar sunuyor. Enteroids kullanımı ihtiyacı olan bir insan modeli bağlılık bölgeye özgü sınırlamalar ve kullanım kolaylığı ile bağırsak ne zaman son derece etkili bir seçimdir. Burada izole edip birincil kök hücre kaynaklı küçük bağırsak enteroids fareler ve prematüre insan bebeklerin bakımını yapma tekniği göstermektedir.
Bağırsak epitel konak savunma bağırsak bariyer bütünlüğünü korumak patojenlere karşı sorumluluğunuz vardır ve çeşitli hastalıkların patogenezinde çiğnenebilmektedir birçok hücresel türlerinden oluşur. Hayvan modelleri hastalık bazı yönleriyle özetlemek, fareler ve insanlar bağırsağın türetilmiş enteroids ex vivo modelinin çeşitli tedaviler etkilerini test etmek için bir platform sağlar. Enteroid modeli önemini araştırmacılar kültür ve bağırsak kök hücre saf ya da h…
The authors have nothing to disclose.
MG hibe K08DK101608 ve R03DK111473 Ulusal Sağlık enstitüleri, Mart, Dimes Vakfı Hibe No 5-FY17-79, çocuk Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi ve Anabilim Dalı tarafından desteklenmektedir Pediatri Washington Üniversitesi School of tıp, St. Louis. CJL R01DK104946 tarafından desteklenmektedir (PI: Silverman), çocukların Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |