Enzymatische Kaskade Reaktionen für die Synthese von chirale Alkohole Aminosäure L-Lysin
Summary
Chirale Amino-Alkohole sind vielseitige Moleküle für den Einsatz als Gerüste in der organischen Synthese. Ausgehend von L-Lysin, synthetisieren wir amino Alkohole durch eine enzymatische Kaskade Reaktion kombiniert Diastereoselective C-H-Oxidation katalysiert durch Dioxygenase gefolgt von Spaltung der Carbonsäure glyko-der entsprechenden Hydroxyl Aminosäure durch eine Decarboxylase.
Abstract
Amino-Alkohole sind vielseitige Verbindungen mit einer Vielzahl von Anwendungen. Beispielsweise haben sie als chirale Gerüste in der organischen Synthese eingesetzt. Ihre Synthese von herkömmlichen organischen Chemie erfordert oft mühsame mehrstufigen Syntheseverfahren mit schwierigen Steuerung der stereochemischen Ausgang. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zum enzymatisch Programmbenutzer Amino-Alkohole leicht verfügbaren L-Lysin in 48 h ab. Dieses Protokoll verbindet zwei chemische Reaktionen, die sehr schwer von herkömmlichen organischen Synthese durchzuführen sind. Bei der ersten Schritt, der Regio und Diastereoselective Oxidation von einer nicht aktivierten C-H-Bindung der Lysin ist-Seitenkette durch ein Dioxygenase katalysiert; eine zweite Regio und Diastereoselective Oxidation, katalysiert durch ein Regiodivergent-Dioxygenase führt zur Bildung von 1,2-Diole. Im letzten Schritt ist die carboxylic Gruppe der alpha Aminosäure durch eine Pyridoxal-Phosphat (PLP)-Decarboxylase (DC) abgespalten. Dieser decarboxylative Schritt betrifft nur die alpha Kohlenstoff der Aminosäure, Beibehaltung der Hydroxyl ersetzt Stereogenic Mitte in der Beta/Gamma-Lage. Die daraus resultierende Amino-Alkohole sind daher optisch bereichert. Das Protokoll wurde auf der Semipreparative-Skala-Synthese von vier Amino-Alkohole erfolgreich angewendet. Überwachung der Reaktionen wurde durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) nach Derivatisierung von 1-Fluor-2,4-Dinitrobenzene durchgeführt. Einfache Reinigung durch Festphasen-Extraktion (SPE) gewährt die Amino-Alkohole mit sehr guten Ausbeuten (93 %, > 95 %).
Introduction
Trotz der Vorteile der Biokatalyse bleibt die Integration der biokatalytische Schritte in synthetischen Wege oder total biokatalytische Routen meist auf enzymatische kinetische Entschließungen beschränkt. Diese Routen haben weithin als ein erster Schritt in asymmetrischen Chemo-enzymatische Synthese, sondern Biokatalyse bietet viel mehr Möglichkeiten in der Funktionsgruppe Interconversions mit hoher Stereoselektivität1,2,3 . Darüber hinaus da biokatalytische Reaktionen unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt werden, ist es daher möglich, Kaskade Reaktionen in einem ein-Topf-Mode4,5durchführen.
Chirale Amino-Alkohole sind vielseitige Moleküle für den Einsatz als Hilfsstoffe oder Gerüste in organische Synthese6. Die amino Alkohol glyko-wird häufig in sekundären Pflanzenstoffen und pharmazeutische Wirkstoffe (API) gefunden. Primären β-amino Alkohole sind leicht zugänglich von der entsprechenden α-Aminosäuren durch konventionelle chemische Synthese, sondern Zugang zu chirale Alkohole γ-amino oder sekundäre amino Alkohole erfordert oft mühsame synthetischen Wege zusammen mit empfindlichen Kontrolle über die Stereochemie7,8,9,10. Aufgrund seiner hohen Stereoselektivität vorsehen Biokatalyse eine überlegene Syntheseweg auf diese chirale Bausteine11,12,13,14.
Wir haben bereits berichtet, die Synthese von Mono – und di-hydroxy-L-Lysines durch enzymatische Hydroxylierung Diastereoselective katalysiert durch Dioxygenases des Eisens (II) / α-Ketoacid-abhängigen Cyclooxygenase Familie (αKAO) (Abbildung 1)15. Vor allem ausgehend von L-Lysin, KDO1 Dioxygenase katalysiert die Bildung von (3S) – hydroxy-Derivat (1), während (4R) – Derivat (2) entsteht durch die Reaktion mit KDO2 Dioxygenase. Aufeinanderfolgenden Regiodivergent Hydroxylations KDO1 und KDO2 führen zur Bildung von (3R, 4R) – Dihydroxy – L-Lysin (3) in optisch reinen Form. Jedoch behindert Bereich begrenzt Substrat dieser Enzyme ihre große Auslastung in der chemischen Synthese, vor allem in die Hydroxylierung von einfachen Aminen, da eine Carbonsäure glyko-in der α-Position der amino-Gruppe für Aktivität16unverzichtbar ist.
Abbildung 1: biokatalytische Umbauten von L-Lysin. Umwandlung in (3S) – hydroxy – L-Lysin (1) katalysiert durch KDO1 Dioxygenase; (4R) – hydroxy – L-Lysin (2) katalysiert durch KDO2 Dioxygenase; und 3R, 4R– Dihydroxy – L-Lysin (3) durch Kaskade Reaktion katalysiert sukzessive durch KDO1 und KDO2 Dioxygenases. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Decarboxylierung ist eine häufige Reaktion im Stoffwechsel17. Insbesondere Aminosäure DCs (EG 4.1.1) sind Kofaktor-frei (Pyruvoyl-abhängig) oder PLP-abhängige Enzyme und katalysieren die Decarboxylierung von Aminosäuren in den entsprechenden Polyamine in Bakterien und höheren Organismen18,19 , 20 , 21 , 22. die Mono – Dihydroxy Verbindungen (Abbildung 3) 4–7, 10–11 entsprechen hydroxylierten Cadaverin, das Diamin durch Decarboxylierung von L-Lysin erhalten. Cadaverin ist ein wichtiger Baustein für die chemische Industrie, speziell eine Komponente von Polyamid und Polyurethan Polymere. Daher biobasierte Herstellung von diesem Diamin aus nachwachsenden Rohstoffen hat Aufmerksamkeit als Alternative zum Erdöl-basierten Weg, und verschiedene Mikroorganismen haben für diesen Zweck entwickelt worden. In diese Stoffwechselwege ist Lysin DC (LDC) das Schlüsselenzym. LDC ist ein PLP-abhängige Enzym, Alanin Racemase (AR) strukturelle Familie23angehören. PLP-Abhängige DCs (PLP-DCs) sind dafür bekannt, hochspezifische Substrat sein. Jedoch wenige Enzyme besitzen die Fähigkeit, leichten Promiskuität, aktiv in Richtung L-Ornithin und L-Lysin Aminosäuren, wie zum Beispiel das LDC aus Selenomonas Rumirantium (LDCSrum), die hat ähnlicher kinetische Konstanten für Lysin und Ornithin zu Decarboxylierung24,25. Dieses erweiterte Substrat Spezifität macht dieses Enzym einen guten Kandidat für die Decarboxylierung von Mono – und di-hydroxy-L-Lysin. Darüber hinaus untersucht, um DCs aktiv in Richtung der Hydroxyl-Derivate von Lysin finden, wir die genomische Kontext der Gene kodieren die αKAO Enzyme. In der Tat sind in prokaryotischen Genomen die Genen Codierung an der gleichen biosynthetische Bahn beteiligten Enzyme in der Regel in gen-Cluster Co lokalisiert. Gens KDO2 (von Chitinophaga Pinensis) fand man zusammen mit einem Gen Kodierung vermeintliche PLP-DC (Abbildung 2) lokalisiert. Im Gegensatz dazu ist keine gen-Codierung für DC gefunden worden, bei der Analyse von genomischen Rahmen KDO1 Dioxygenase. Das PLP-DC-Protein aus C. Pinensis (DCCpin) wurde daher als ein viel versprechender Kandidat ausgewählt, um die Decarboxylierung Schritt der Kaskade Reaktion katalysieren.
Abbildung 2: genomische Kontext des KDO2-Gens in C. Pinensis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Infolgedessen haben wir entwickelt enzymatische Kaskade Reaktionen, Dioxygenases und DCs, die Synthese von aliphatischen chiralen β – und γ-amino Alkohole aus Aminosäuren (Abbildung 3) zu erreichen. Wie bereits berichtet führt die C-H-Oxidation, katalysiert durch die αKAO die Hydroxyl ersetzt Stereogenic Mitte mit insgesamt Diastereoselectivity; die Cβ/γ Chiralität erhalten im decarboxylative Schritt betrifft nur das Cα Carbon der Aminosäure glyko-16.
Abbildung 3: Analyse der retrosynthetischen. (A) Retrosynthesis β – und γ-amino Alkohole (R) – 1,5 – Diaminopentan-2-Ol (4) (5R) – hydroxy – L-Lysin, und (S) – 1,5 – Diaminopentan-2-Ol (5) und 1,5-Diaminopentan-3-Ol (6) aus L-Lysin. (B) Retrosynthesis β, γ und δ-amino Diole (2S, 3S) β – 1,5 – Diaminopentane-2,3-Diol (10) und (2R, 4S) – 1,5 – Diaminopentane-2,4-Diol (11) ab (5R)- Hydroxy-L-Lysin, und 2R, 3R– 1,5 – Diaminopentane-2,3-Diol (7) ab L-Lysin. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
L-Lysin und seine (5R) ab-hydroxy-Derivat, berichten wir hierin eine zwei/drei Schritt, einen Topf, enzymatischen Verfahren, die Kombination von Dioxygenases und PLP-DCs, das Ziel Amino-Alkohole zu erhalten. Vor der Synthese im Labormaßstab der Zielmoleküle, die Methode wurde entwickelt auf der analytischen Ebene Anpassung der Reaktionsbedingungen, z.B., die Enzymkonzentrationen erforderlich, um vollständige Umwandlung der Ausgangsstoffe; ermöglichen Wir präsentieren dieses Verfahrens sowie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chirale Alkohole Aminosäuren und Derivate haben eine breite Palette von Anwendungen, von chiralen Hilfsmittel für die organische Synthese zur medikamentösen Therapie. Mehrstufigen Synthese zur Herstellung von Amino-Alkohole durch herkömmliche organische Synthese sind zahlreich, aber möglicherweise nicht immer effizient durch mühsame Schutz/Deprotection Schritte zusammen mit eine feinfühlige Steuerung der Stereochemie16. Ein biokatalytische Ansatz, der die Schutz/Deprotection Schritte verzic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Véronique de Berardinis für fruchtbare Diskussionen und Alain Perret, Christine Pellé und Peggy Sirvain für den technischen Support.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
| (5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
| α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
| Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
| 3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
| 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
| Ethanol | VWR | 20825.290 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
| HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
| HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
| Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
| 2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
| Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
| Formic acid | Acros | 270480010 | |
| Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
| Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
| Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
| Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
| 4mm syringe filters – 0,22µm – PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
| Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
| Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
| Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
| Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
| Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
| Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
| Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
| Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
| Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
| 300 MHz spectrometer | Bruker | ||
| 2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
| 25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
| 100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |
References
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