Legatura del dotto biliare parziale nel topo: un modello radiocomandato di colestasi ostruttiva localizzata
Summary
Qui, presentiamo la legatura dei dotti biliari parziale come un modello chirurgico della lesione del fegato e la rigenerazione in roditori.
Abstract
Nei roditori, la legatura del dotto biliare completa (cBDL) del dotto biliare comune è una tecnica chirurgica consolidata per lo studio della proliferazione del dotto biliare e colestasi ostruttiva. Tuttavia, esperimenti a lungo termine possono portare a un aumento della morbilità e la mortalità. In ceppi di selezione del mouse con affezione epatica di fondo, confronti significativi possono avvenire anche con la legatura di un singolo lobo del fegato, che può ridurre le spese e le perdite degli animali. Qui, descriviamo la legatura parziale dei dotti biliari (pBDL) nel topo, in cui solo il sinistra dei dotti biliari epatici è legato, causando ostruzione biliare nel lobo di sinistra ma non i lobi rimanenti. Con un’attenta tecnica microchirurgica, esperimenti di pBDL possono essere convenienti, poiché il lobo deossiHb serve come controllo interno ai lobi legati, quando sottoposti alle stesse condizioni dello stesso animale. A differenza di cBDL, un gruppo di controllo sham-operated separato non è necessario. pBDL è altamente utile direttamente confronta localizzato contro effetti sistemici di colestasi e altri componenti di bile mantenuto. pBDL può essere riproposto anche come un nuovo metodo per studiare i meccanismi legati ai farmaci e migrazione cellulare.
Introduction
Modelli chirurgici di lesioni epatiche acute e riparazione, ad esempio hepatectomy parziale o legatura del dotto biliare comune (cBDL), sono stati utilizzati per decenni in roditori per studiare la rigenerazione del fegato e patobiologia1,2. In cBDL, il dotto biliare comune (che drena tutta bile prodotta nel fegato) è legato, con conseguente colestasi ostruttiva, infiammazione e fibrosi nelle prime 2-3 settimane dopo la chirurgia, con eventuale progressione verso la cirrosi3. Proliferazione dei dotti biliari, transdifferenziazione e induzione di cellule staminali e progenitori residenti del fegato sono anche caratteristiche di cBDL4,5. Anche se cBDL delucida meccanismi specifici di colangiopatia ostruttiva, che sono ben caratterizzati con risultati riproducibili nei topi wild-type e in quegli sforzi con fegati normali6,7,8, la procedura può essere tecnicamente impegnativo in alcuni modelli di topi transgenici di malattie del fegato, che richiedono gli animali più del previsto a causa di più alta morbilità e mortalità dell’ostruzione biliare nel corso del tempo. Questa tecnica è anche utile per lo studio della malattia di topi transgenici con sottostanti del fegato, che altrimenti non potrebbe tollerare lo stress degli esperimenti di corso di tempo prolungato dopo cBDL.
pBDL può fornire un’alternativa ragionevole per aiutare a superare alcune di queste sfide. PBDL iniziale studi nei topi wild-type volti a distinguere localmente recitazione e sistemici di mediatori di infiammazione9. In pBDL, la confluenza biliare principale dei dotti biliari epatici destro e sinistro sopra il dotto biliare comune è attentamente fruita al hilum, e solo il sinistra dei dotti biliari epatici è legato per generare una colestasi ostruttiva localizzata. pBDL offre diversi vantaggi ai cBDL. In pBDL, il lobo di destra deossiHb serve come controllo interno identicamente abbinato per il lobo di sinistra legato, sottoposto agli stessi effetti sistemici, quali lo stato nutrizionale o fattori di circolazione. Anche se mediatori pro-infiammatori sistemici erano presenti, Osawa et al osservati meno fibrosi e necrosi nei lobi deossiHb, ma aumentato di cellule infiammatorie e l’espressione di fattore di crescita-β trasformante nel lobo dei9.
Più recentemente, pBDL è stato ridefinito per studiare gli effetti sul fegato parenchimatici di bile mantenuto10. Utilizzando lo stesso animale per il controllo interno (deossiHb “falsità”) e nei gruppi sperimentali, pBDL in modo efficace dimezza il numero di animali necessari per esperimento, che a sua volta è più conveniente. I topi tollerano gli effetti di pBDL molto meglio, in modo che il momento ideale corso sperimentare (≥ 2 settimane) possono essere raggiunto nel lobo legato. La cosa più importante, pBDL in grado di distinguere gli effetti diretti intraepatici di colestasi ostruttiva e mantenuto componenti della bile nel lobo legato, rispetto al lobo deossiHb controllo. Nel complesso, pBDL è un interessante metodo per studiare gli effetti specifici del lobo di colestasi localizzata nel fegato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se cBDL è la più comune tecnica sperimentale per colestasi ostruttiva, può presentare molteplici sfide in roditori. A seconda del numero di giorni post-operatori necessaria per ottenere un endpoint, gli animali possono sperimentare significativa morbidità e mortalità mentre il tempo progredisce. Il grado di lesione del tessuto e necrosi biliare è ulteriormente aggravato quando si lavora con alcuni modelli di mouse transgenici dell’affezione epatica, che dimostrano il parenchima del fegato anormale e funzione …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Khan riconosce sovvenzioni da NIH/NICHD K12HD052892, Alpha-1 Foundation, la Fondazione di Hillman e il centro di ricerca del fegato di Pittsburgh. Dr. Michalopoulos riconosce sovvenzioni da NIH/NIDDK P01DK096990. Apprezziamo l’assistenza tecnica eccellente e generoso di Anne Orr. Siamo anche grati al Dr. David A. Geller per fornire l’accesso al laboratorio di microchirurgia trapianto/roditore.
Materials
| Microscope-Leica Wild M650, 6–40× magnification | Leica Microsystems | n/a | |
| Tec 3 isoflurane funnel fill vaporizer | General Anesthetic Services | n/a | |
| Stevens Tenotomy Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation | ASSI.9193 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | |
| Mosquito classic delicate hemostatic forceps | Codman | 30-4472 | |
| Micro-retractor | Murdock; Roboz Surgical Instrument | RS-6550 | |
| Nonwoven gauze sponges | Fisherband | 870-PC-DBL | |
| Puritan 6” Small Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company | 868-WCS | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-23 | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Angled 45°/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-25 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine science tools | 15000-00 | |
| Microneedle holder | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | |
| Micro AROSuture, sterile 10-0 nylon suture, 70 µm, TAP points | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J662H | |
| 5-ml Syringe | BD | 309646 | |
| Falcon tissue culture dish, 60 × 15 mm | Corning | 353002 | |
| Isoflurane, United States Pharmacopeia (USP) liquid for inhalation, 250 ml | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | |
| Buprenex injectable (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496-0757-1 | |
| Cefazolin for injection , USP | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-238-61 | |
| PVP scrub solution (povidone–iodine 7.5%) | Medline | NDC 12496-0757-1 | |
| 70% Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Phosphate Buffered Saline Without Calcium or Magnesium | LONZA | 17-516F | |
| Sirius Red | Sigma | 365548 | |
| Hematolxylin | Fisher (Richard-Allan Scientific) | 22-050-111 (7211) | |
| Eosin | Anatech (Fisher) | 832 (NC9686037) | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 |
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