Ligadura do colédoco parcial no Mouse: um modelo controlado da colestase obstrutiva localizada
Summary
Aqui, apresentamos a ligadura parcial biliar como modelo cirúrgico de lesão hepática e regeneração em roedores.
Abstract
Em roedores, ligadura do colédoco completa (cBDL) do ducto biliar comum é uma técnica cirúrgica estabelecida para estudar a proliferação de colestase e ducto biliar obstrutiva. No entanto, as experiências a longo prazo podem levar a aumento da morbidade e mortalidade. Em cepas do mouse selecione com doença hepática subjacente, uma comparação significativa pode ser feita mesmo com ligadura de um único lóbulo do fígado, que pode reduzir as despesas e perdas de animais. Aqui, descrevemos a ligadura parcial de ducto biliar (pBDL) no rato, no qual é ligado somente à esquerda hepático ducto biliar, causando obstrução biliar no lobo esquerdo, mas não os lóbulos remanescentes. Com cuidado técnica microcirúrgica, experimentos de pBDL podem ser rentáveis, desde que o lobo unligated serve como um controle interno para os lóbulos ligados, quando submetidos às mesmas condições no mesmo animal. Ao contrário da cBDL, um grupo de controle de operação separado não é necessário. pBDL é altamente útil diretamente comparar localizada contra efeitos sistêmicos de colestase e outros componentes da bile retida. pBDL também pode ser reaproveitado como um novo método para investigar os mecanismos relacionados a medicamentos e a migração celular.
Introduction
Modelos cirúrgicos da lesão hepática aguda e reparação, tais como hepatectomy parcial ou ligadura do ducto biliar comum (cBDL), têm sido utilizados há décadas em roedores para estudar a regeneração hepática e Patobiológico1,2. Em cBDL, é ligado o ducto biliar comum (que drena todas bile produzida no fígado), resultando em colestase obstrutiva, inflamação e fibrose nas primeiras 2-3 semanas após a cirurgia, com eventual progressão para cirrose3. Proliferação do ducto biliar, transdiferenciação celular e indução de células progenitoras de fígado residente são também características da cBDL4,5. Embora cBDL elucida mecanismos específicos de cholangiopathy obstrutiva, que são bem caracterizados com resultados reprodutíveis em ratos do selvagem-tipo e nessas cepas com fígados normal6,7,8, o procedimento pode ser tecnicamente exigente em alguns modelos de rato transgénico, doenças do fígado, que exigem mais animais do que o previsto devido à maior morbidade e mortalidade de obstrução biliar, ao longo do tempo. Esta técnica é também benéfica para estudar doença de ratos transgénicos com subjacentes fígado, que não pode tolerar senão o stress das experiências de curso prolongado após cBDL.
pBDL pode fornecer uma alternativa razoável para ajudar a superar alguns desses desafios. Estudos de pBDL inicial em ratos do selvagem-tipo visa distinguir localmente atuante e sistêmicos de mediadores da inflamação9. De pBDL, confluência biliar principal de direita e esquerdas hepáticas biliares acima o ducto biliar comum com cuidado é visualizada no hilo, e apenas esquerdo hepático ducto biliar é ligado para gerar uma colestase obstrutiva localizada. pBDL oferece várias vantagens para cBDL. De pBDL, unligated lóbulo direito serve como um controle interno forma idêntica correspondente para o lobo esquerdo ligado, sujeitado para os mesmos efeitos sistêmicos, tais como o estado nutricional ou fatores de circulação. Embora mediadores pró-inflamatórios sistêmicos estavam presentes, Osawa et al observou menos fibrose e necrose dos lóbulos unligated, mas aumento de células inflamatórias e expressão de crescimento fator-β transformador do lóbulo ligados9.
Mais recentemente, foi redefinido para estudar efeitos parenquimatosos hepáticas da bile retida10pBDL. Usando o mesmo animal para controle interno (unligated “sham”) e grupos experimentais, pBDL metades efetivamente o número de animais necessários por experiência, que por sua vez, é mais rentável. Os ratos toleram os efeitos de pBDL muito melhor, para que o tempo ideal de curso experimentar (≥2 semanas) podem ser alcançadas no lóbulo ligado. Mais importante ainda, pBDL pode distinguir efeitos directos de colestase da colestase obstrutiva e retidos componentes da bile no lóbulo ligado, em comparação com o lobo de unligated controle. Em geral, pBDL é um método atrativo para estudar efeitos específicos do lóbulo da colestase localizada no fígado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora cBDL é a mais comum técnica experimental para colestase obstrutiva, pode apresentar vários desafios em roedores. Dependendo do número de dias pós-operatórios necessários para alcançar um ponto de extremidade, os animais podem experimentar significativa morbidade e mortalidade que o tempo avança. O grau de lesão tecidual e necrose biliar é ainda agravado quando se trabalha com alguns modelos de rato transgénico de doença hepática, que demonstram o parênquima hepática anormal e função na linha de b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Khan reconhece apoio de concessão da K12HD052892 NIH/FORMULADORES, a Alpha-1 Foundation, Fundação Hillman e centro de pesquisa do fígado de Pittsburgh. Dr. Michalopoulos reconhece apoio de concessão do NIH/NIDDK P01DK096990. Agradecemos a assistência técnica excelente e generosa de Anne Orr. Nós também estamos gratos ao Dr. David A. Geller para fornecer acesso ao laboratório de microcirurgia do transplante/roedor.
Materials
| Microscope-Leica Wild M650, 6–40× magnification | Leica Microsystems | n/a | |
| Tec 3 isoflurane funnel fill vaporizer | General Anesthetic Services | n/a | |
| Stevens Tenotomy Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation | ASSI.9193 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | |
| Mosquito classic delicate hemostatic forceps | Codman | 30-4472 | |
| Micro-retractor | Murdock; Roboz Surgical Instrument | RS-6550 | |
| Nonwoven gauze sponges | Fisherband | 870-PC-DBL | |
| Puritan 6” Small Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company | 868-WCS | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-23 | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Angled 45°/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-25 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine science tools | 15000-00 | |
| Microneedle holder | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | |
| Micro AROSuture, sterile 10-0 nylon suture, 70 µm, TAP points | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J662H | |
| 5-ml Syringe | BD | 309646 | |
| Falcon tissue culture dish, 60 × 15 mm | Corning | 353002 | |
| Isoflurane, United States Pharmacopeia (USP) liquid for inhalation, 250 ml | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | |
| Buprenex injectable (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496-0757-1 | |
| Cefazolin for injection , USP | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-238-61 | |
| PVP scrub solution (povidone–iodine 7.5%) | Medline | NDC 12496-0757-1 | |
| 70% Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Phosphate Buffered Saline Without Calcium or Magnesium | LONZA | 17-516F | |
| Sirius Red | Sigma | 365548 | |
| Hematolxylin | Fisher (Richard-Allan Scientific) | 22-050-111 (7211) | |
| Eosin | Anatech (Fisher) | 832 (NC9686037) | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 |
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