Ligadura del conducto biliar parcial en el ratón: un modelo controlado de la colestasis obstructiva localizada
Summary
Presentamos la ligadura del conducto biliar parcial como modelo quirúrgico de lesión hepática y regeneración en roedores.
Abstract
En roedores, ligadura del conducto biliar completa (cBDL) del conducto biliar común es una técnica quirúrgica establecida para el estudio de colestasis obstructiva, proliferación de conducto biliar. Sin embargo, experimentos a largo plazo pueden conducir a mayor morbilidad y mortalidad. En cepas de ratón seleccione con enfermedad hepática subyacente, se pueden hacer comparaciones significativas aun con la ligadura de un solo lóbulo del hígado, que puede reducir los gastos y pérdidas de animales. Aquí, describimos la ligadura parcial del conducto biliar (pBDL) en el ratón, en el que sólo el conducto biliar hepático izquierdo está ligado, que causa obstrucción biliar en lóbulo izquierdo pero no los lóbulos restantes. Con Técnica Microquirúrgica cuidadosa, pBDL experimentos pueden ser rentables, ya que el lóbulo unligated sirve como un control interno a los lóbulos ligados, cuando se someten a las mismas condiciones en el mismo animal. A diferencia de cBDL, un grupo de control independiente operado simulada no es necesario. pBDL es muy útil para comparar directamente localizada versus efectos sistémicos de la colestasis y otros componentes de la bilis retenida. también puede reutilizar pBDL como un nuevo método para investigar mecanismos relacionados con medicamentos y migración celular.
Introduction
Los modelos quirúrgicos de reparación, como la hepatectomía parcial o ligadura del conducto biliar común (cBDL) y lesión del higado aguda se han utilizado durante décadas en roedores para estudiar la regeneración del hígado y pathobiology1,2. En cBDL, es ligado el conducto colédoco (que drena toda la bilis producida en el hígado), dando por resultado colestasis obstructiva, la inflamación y la fibrosis en las primeras 2-3 semanas después de la cirugía, con eventual progresión a la cirrosis3. Proliferación de conductos biliares, transdiferenciación e inducción de células progenitoras residentes de hígado son también características de cBDL4,5. Aunque cBDL elucida mecanismos específicos de cholangiopathy obstructiva, que están bien caracterizados con resultados reproducibles en ratones de tipo salvaje y en esas tensiones con hígados normales6,7,8, la procedimiento puede ser técnicamente exigente en algunos modelos de ratón transgénico de enfermedades del hígado, que requieren más animales de lo previsto debido a la mayor morbilidad y mortalidad de la obstrucción biliar en el tiempo. Esta técnica también es beneficiosa para el estudio de la enfermedad de ratones transgénicos con base de hígado, que de lo contrario no podría tolerar el estrés de los experimentos de curso prolongado tras cBDL.
pBDL puede proporcionar una alternativa razonable para ayudar a superar algunos de estos retos. PBDL inicial estudios en ratones de tipo salvaje pretenden distinguir localmente actuando y sistémicos mediadores de la inflamación9. En pBDL, cuidadosamente, la confluencia biliar principal de los conductos biliares hepáticos derecho e izquierdos por encima del conducto biliar común se visualiza en el hilum, y sólo el conducto biliar hepático izquierdo se unen para generar una colestasis obstructiva localizada. pBDL ofrece varias ventajas a cBDL. En pBDL, el lóbulo derecho unligated sirve como un control interno idénticamente coincidente para el lóbulo izquierdo ligado, sometido a los mismos efectos sistémicos, tales como estado nutricional o factores de circulación. Aunque estaban presentes mediadores pro-inflamatorios sistémicos, Osawa et al. había observado menos fibrosis y necrosis en los lóbulos unligated, pero aumento de células inflamatorias y expresión de factor de crecimiento β transformador en el lóbulo ligados9.
Más recientemente, se ha redefinido pBDL para estudiar efectos parenquimales hepáticas de bilis retenida10. Utilizando el mismo animal para los grupos experimentales y control interno (unligated “sham”), pBDL mitades con eficacia el número de animales necesarios por experimento, que a su vez es más rentable. Los ratones toleran los efectos de pBDL mucho mejor, para que el momento ideal curso de experimentar (≥2 semanas) pueden lograrse en el lóbulo ligado. Lo más importante, pBDL puede distinguir efectos directos intrahepáticas de colestasis obstructiva y conservan componentes de la bilis en el lóbulo ligado, comparado con el lóbulo de la unligated control. En general, pBDL es un método atractivo para estudiar efectos de lóbulo-específica de la colestasis localizada en el hígado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque cBDL es la técnica experimental más común de colestasis obstructiva, puede presentar múltiples desafíos en roedores. Dependiendo del número de días postoperatorios requeridos para alcanzar un punto final, los animales pueden experimentar una morbilidad significativa y mortalidad as time avanza. El grado de lesión tisular y necrosis biliar es exacerbado cuando se trabaja con algunos modelos de ratón transgénico de enfermedad hepática, que demuestran anormal parénquima hepático y la función al inicio d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El Dr. Khan reconoce apoyo de subvenciones de NIH/NICHD K12HD052892, la Fundación alfa-1, la Fundación Hillman y el centro de investigación de hígado Pittsburgh. Dr. Michalopoulos reconoce apoyo de subvención del NIH/NIDDK P01DK096990. Agradecemos la asistencia técnica excelente y generosa de Anne Orr. Agradecemos también al Dr. David A. Geller para facilitar el acceso al laboratorio de microcirugía de trasplante/roedor.
Materials
| Microscope-Leica Wild M650, 6–40× magnification | Leica Microsystems | n/a | |
| Tec 3 isoflurane funnel fill vaporizer | General Anesthetic Services | n/a | |
| Stevens Tenotomy Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation | ASSI.9193 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | |
| Mosquito classic delicate hemostatic forceps | Codman | 30-4472 | |
| Micro-retractor | Murdock; Roboz Surgical Instrument | RS-6550 | |
| Nonwoven gauze sponges | Fisherband | 870-PC-DBL | |
| Puritan 6” Small Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company | 868-WCS | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-23 | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Angled 45°/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-25 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine science tools | 15000-00 | |
| Microneedle holder | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | |
| Micro AROSuture, sterile 10-0 nylon suture, 70 µm, TAP points | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J662H | |
| 5-ml Syringe | BD | 309646 | |
| Falcon tissue culture dish, 60 × 15 mm | Corning | 353002 | |
| Isoflurane, United States Pharmacopeia (USP) liquid for inhalation, 250 ml | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | |
| Buprenex injectable (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496-0757-1 | |
| Cefazolin for injection , USP | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-238-61 | |
| PVP scrub solution (povidone–iodine 7.5%) | Medline | NDC 12496-0757-1 | |
| 70% Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Phosphate Buffered Saline Without Calcium or Magnesium | LONZA | 17-516F | |
| Sirius Red | Sigma | 365548 | |
| Hematolxylin | Fisher (Richard-Allan Scientific) | 22-050-111 (7211) | |
| Eosin | Anatech (Fisher) | 832 (NC9686037) | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 |
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