Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie
Summary
Het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige genomic DNA van tumor weefsels is een essentiële eerste stap voor het analyseren van de genetische veranderingen met behulp van de volgende generatie sequencing. In dit artikel presenteren we een eenvoudige en snelle methode om tumorcellen te verrijken en te verkrijgen intact DNA touch Impressum cytologie specimens.
Abstract
Het is van cruciaal belang om te bepalen van de vogelgriepvirus status in kanker voor beheer en behandeling van specifieke moleculaire gerichte drugs voor kankerpatiënten. In de klinische setting, worden formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels veel gebruikt voor genetische tests. FFPE DNA is echter over het algemeen beschadigd en gefragmenteerd tijdens het proces van de fixatie met formaline. FFPE DNA is daarom soms niet voldoende voor genetische tests vanwege de lage kwaliteit en kwantiteit van DNA. Hier presenteren we een methode van aanraking Impressum Cytologie (TIC) te verkrijgen van genomic DNA van kankercellen, die onder een microscoop kan worden waargenomen. Cel morfologie en kanker cel nummers kan worden geëvalueerd met behulp van TIC exemplaren. Bovendien kan de extractie van DNA genomic van TIC monsters worden voltooid binnen twee dagen. De totale hoeveelheid en de kwaliteit van TIC DNA verkregen met behulp van deze methode was hoger dan die van FFPE DNA. Deze snelle en eenvoudige methode kunt onderzoekers voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige DNA voor genetische tests (bv, volgende generatie sequentie analyse, digitale PCR en kwantitatieve real-time PCR) en aan het verkorten van de doorlooptijd voor het rapporteren van resultaten.
Introduction
Volgende generatie sequencing technologie heeft verstrekt onderzoekers aanzienlijke vooruitgang bij het analyseren van de genoominformatie in genetische variaties, Mendelian ziekte, erfelijke aanleg en kanker 1,2,3 . De kanker genoom Atlas (TCGA) en de internationale kanker genoom Consortium (ICGC) hebben de identificatie van genetische wijzigingen in de verschillende soorten gemeenschappelijk kankers4nagestreefd. Honderden essentiële stuurprogramma kankergenen met succes zijn geïdentificeerd, en sommige van deze moleculen worden gericht voor drug ontwikkeling1,5,6.
In de klinische setting, worden FFPE specimens vaak gebruikt voor pathologische diagnose en moleculaire tests voor verschillende ziekten, waaronder kanker. Echter tijdens de fixatie met formaline, DNA-eiwit of DNA-DNA dwarsbinding optreedt en fragmentatie van DNA wordt geïnduceerd. Dus, FFPE DNA-monsters zijn niet altijd geschikt voor genetische analyse vanwege de lage kwaliteit en kwantiteit van DNA7,8,9. Bovendien duurt het enkele dagen te bereiden FFPE specimens en technische vaardigheid nodig is om te nauwkeurig bereiden de secties. Daarom is het wenselijk een eenvoudige en snelle methode voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige intact DNA te ontwikkelen.
Cytologie is een alternatieve methode voor pathologische diagnose. Cytologische monstervoorbereiding is een eenvoudiger, minder duur en sneller benadering in vergelijking met FFPE voorbereiding10. De TIC-techniek is uitgevoerd op sentinel lymfklieren en marginale weefsels van borstkankerpatiënten voor intraoperatieve snelle diagnose voor enkele jaren11,12. Echter, er zijn weinig rapporten die hebben onderzocht of genomic DNA van hoge kwaliteit kan worden geëxtraheerd uit TIC monsters en gebruikt voor volgende genetische analyse. Cytologische exemplaren zijn vaak gekleurd met Papanicolaou (Pap) of Giemsa-kleuring, en we eerder gemeld dat de hoeveelheid en de kwaliteit van DNA geëxtraheerd uit TIC monsters (vooral Giemsa gebeitste monsters) superieur aan monsters van FFPE zijn weefsels13. Vergeleken met Pap vlekken, heeft Giemsa-kleuring een voordeel in vereisen minder verkleurende procedures. In Pap vlekken, nadat de monsters zijn vaste en gekleurd, moeten zij worden gemonteerd met montage medium (bijvoorbeeld, Malinol) voor het monster inhoud, zoals tumorcellen, normale cellen en ontstekingscellen onder een microscoop te onderscheiden. Als het model van de Pap bereid is zonder de stap van de montage, is het bijna onmogelijk te observeren van de cellen onder een Microscoop, omdat het model wordt gedroogd. Ter vergelijking: Giemsa-kleuring kan worden waargenomen in de gedroogde staat, dus de montage stap is niet nodig voor snelle cellulaire evaluatie. Voor microdissection is Giemsa-kleuring geschikter omdat droge exemplaren.
In dit verslag, we voeren een eenvoudige en snelle methode voor het voorbereiden van de TIC exemplaren met Giemsa-kleuring en aantonen dat TIC een betere bron voor DNA in vergelijking met FFPE exemplaren is.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie presenteerden we een alternatieve methode voor het verkrijgen van tumor DNA uit klinische pathologische monsters met behulp van de TIC. Voorbereiding van het TIC is zeer eenvoudig en minder tijd in vergelijking met FFPE methoden, zonder de behoefte aan speciale instrumenten10nodig heeft. Alle procedures van de TIC-voorbereiding voor DNA-extractie kunnen worden voltooid binnen twee dagen (Figuur 1). Deze methode dus verkort de doorlooptijd voor het uitvo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken alle medische en ondersteunende medewerkers van het ziekenhuis en de patiënten voor toestemming om deel te nemen. Wij danken Gabrielle White Wolf, PhD, van de Edanz groep (www.edanzediting.com/ac) voor het bewerken van een ontwerp van dit verslag. Deze studie werd ondersteund door een Grant-in-Aid voor genoom-onderzoeksproject van de prefectuur Yamanashi (Y.H. en M.O.) en een subsidie van de YASUDA medische Foundation (Y.H.).
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer – Three Strikes and You’re Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
- Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
- Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
- Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
- Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
- Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
- Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
- Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
- Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
- Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
- Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
- Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
- Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
- Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).
