स्पर्श छाप Cytology का उपयोग नैदानिक रोग नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले ट्यूमर डीएनए प्राप्त करने के लिए सरल और तेजी से विधि
Summary
ट्यूमर के ऊतकों से उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के आनुवंशिक परिवर्तन अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग कर का विश्लेषण करने के लिए एक आवश्यक पहला कदम है । इस अनुच्छेद में, हम ट्यूमर कोशिकाओं को समृद्ध और स्पर्श छाप cytology नमूनों से बरकरार डीएनए प्राप्त करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
यह प्रशासन और कैंसर रोगियों के लिए विशिष्ट आणविक लक्षित दवाओं के उपचार से पहले कैंसर में उत्परिवर्तन की स्थिति का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है । नैदानिक सेटिंग में, formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतकों को व्यापक रूप से आनुवंशिक परीक्षण के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, FFPE डीएनए आम तौर पर क्षतिग्रस्त और formalin के साथ निर्धारण की प्रक्रिया के दौरान खंडित है । इसलिए, डीएनए की कम गुणवत्ता और मात्रा की वजह से FFPE डीएनए कभी-कभार आनुवंशिक परीक्षण के लिए पर्याप्त नहीं होता है । यहाँ हम स्पर्श छाप cytology (टिक) कैंसर कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के लिए एक विधि मौजूद है, जो एक खुर्दबीन के नीचे मनाया जा सकता है. कक्ष आकृति विज्ञान और कैंसर कोशिका संख्या टिक नमूनों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा, टिक नमूनों से जीनोमिक डीएनए की निकासी दो दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है । कुल राशि और टिक डीएनए की गुणवत्ता इस विधि का उपयोग कर प्राप्त की है कि FFPE डीएनए की तुलना में अधिक था । इस तेजी से और सरल विधि शोधकर्ताओं आनुवंशिक परीक्षण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है (उदा, अगली पीढ़ी अनुक्रमण विश्लेषण, डिजिटल पीसीआर, और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर) और परिणाम रिपोर्टिंग के लिए बदलाव समय छोटा करने के लिए ।
Introduction
अगली पीढ़ी sequencing प्रौद्योगिकी आनुवंशिक विविधताओं, Mendelian रोग, वंशानुगत गड़बड़ी में जीनोम जानकारी का विश्लेषण करने में शोधकर्ताओं ने महत्वपूर्ण प्रगति प्रदान की है, और कैंसर 1,2,3 . कैंसर जीनोम एटलस (TCGA) और अंतरराष्ट्रीय कैंसर जीनोम कंसोर्टियम (ICGC) आम कैंसर के कई प्रकार में आनुवंशिक परिवर्तन की पहचान का पीछा किया है4। आवश्यक कैंसर चालक जीन के सैकड़ों सफलतापूर्वक पहचान की गई है, और इन अणुओं के कुछ दवा विकास1,5,6के लिए लक्षित किया जा रहा है ।
नैदानिक सेटिंग में, FFPE नमूनों आमतौर पर कैंसर सहित विभिन्न रोगों के लिए रोग निदान और आणविक परीक्षण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि, formalin के साथ निर्धारण की प्रक्रिया के दौरान, डीएनए-प्रोटीन या डीएनए-डीएनए पार से जोड़ने होता है और डीएनए विखंडन प्रेरित है । इस प्रकार, FFPE डीएनए के नमूनों हमेशा कम गुणवत्ता और डीएनए की मात्रा की वजह से आनुवंशिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं7,8,9. इसके अतिरिक्त, यह FFPE नमूनों को तैयार करने के लिए कई दिन लगते हैं, और तकनीकी कौशल सही वर्गों को तैयार करने के लिए आवश्यक है । इसलिए, उच्च गुणवत्ता बरकरार डीएनए प्राप्त करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि विकसित करने के लिए वांछनीय है ।
Cytology रोग निदान के लिए एक वैकल्पिक तरीका है । कोशिकाविज्ञान नमूना तैयारी एक सरल, कम खर्चीला है, और अधिक तेजी से दृष्टिकोण FFPE तैयारी के साथ की तुलना में10. टिक तकनीक intraoperative तेजी से निदान के लिए कुछ वर्षों के लिए स्तन कैंसर रोगियों से प्रहरी लिम्फ नोड्स और सीमांत ऊतकों पर प्रदर्शन किया गया है11,12। हालांकि, वहां कुछ रिपोर्टों है कि क्या उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए टिक नमूनों से निकाला जा सकता है और बाद में आनुवंशिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल की जांच की है । कोशिकाविज्ञान नमूनों सामांयतः Papanicolaou (पीएपी) या Giemsa धुंधला के साथ दाग रहे हैं, और हम पहले की सूचना दी है कि राशि और डीएनए की गुणवत्ता टिक नमूनों से निकाले (विशेष रूप से Giemsa-दाग नमूनों) FFPE से प्राप्त नमूनों को बेहतर कर रहे है 13ऊतक । पीएपी धुंधला के साथ तुलना में, Giemsa धुंधला कम धुंधला प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है में एक फायदा है । पीएपी धुंधला में, के बाद नमूनों को ठीक किया गया है और सना हुआ, वे बढ़ते मध्यम (उदा, Malinol) नमूना सामग्री, जैसे ट्यूमर कोशिकाओं, सामांय कोशिकाओं, और एक खुर्दबीन के नीचे भड़काऊ कोशिकाओं के रूप में भेद के लिए के साथ घुड़सवार किया जाना चाहिए । यदि पीएपी नमूना बढ़ते कदम के बिना तैयार है, यह लगभग एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण क्योंकि नमूना सूख गया है असंभव है । इसकी तुलना में, Giemsa धुंधला सूख राज्य में मनाया जा सकता है, इसलिए, बढ़ते कदम त्वरित सेलुलर मूल्यांकन के लिए आवश्यक नहीं है । microdissection के लिए, Giemsa धुंधला अधिक उपयुक्त है क्योंकि यह शुष्क नमूनों की आवश्यकता है ।
इस रिपोर्ट में, हम Giemsa धुंधला के साथ टिक नमूनों की तैयारी के लिए एक सरल और तेजी से विधि लागू करने और प्रदर्शन है कि टिक FFPE नमूनों के साथ तुलना में डीएनए के लिए एक बेहतर स्रोत है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हम नैदानिक रोग नमूनों से टिक का उपयोग कर ट्यूमर डीएनए प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति प्रस्तुत किया । टिक तैयारी बहुत आसान है और FFPE तरीकों के साथ तुलना में कम समय की जरूरत है, विशेष उ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अस्पताल के सभी चिकित्सा और सहायक स्टाफ और मरीजों को भाग लेने के लिए सहमति के लिए धंयवाद । हम Gabrielle व्हाइट वुल्फ, पीएचडी, Edanz समूह (www.edanzediting.com/ac) से इस रिपोर्ट का एक मसौदा संपादन के लिए धंयवाद । इस अध्ययन के Yamanashi प्रांत (Y.H. और M.O.) और YASUDA मेडिकल फाउंडेशन (Y.H.) से एक अनुदान से जीनोम अनुसंधान परियोजना के लिए एक अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer – Three Strikes and You’re Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
- Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
- Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
- Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
- Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
- Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
- Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
- Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
- Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
- Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
- Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
- Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
- Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
- Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).
