Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia
Summary
L’ottenimento di DNA genomico di alta qualità dai tessuti del tumore è un primo passo essenziale per analizzare le alterazioni genetiche mediante sequenziamento di nuova generazione. In questo articolo, presentiamo un metodo semplice e rapido per arricchire le cellule del tumore e ottenere DNA intatto dal tocco impronta campioni citologici.
Abstract
È fondamentale per determinare lo stato mutazionale nel cancro prima amministrazione e trattamento di farmaci a bersaglio molecolare specifici per malati di cancro. In ambito clinico, formalina-fisso tessuti di paraffina (FFPE) sono ampiamente utilizzati per i test genetici. Tuttavia, FFPE DNA generalmente è danneggiata e frammentato durante il processo di fissazione in formalina. Di conseguenza, FFPE DNA non è a volte adeguata per test genetici a causa della bassa qualità e quantità di DNA. Qui presentiamo un metodo di citologia di impronta di tocco (TIC) per ottenere il DNA genomico da cellule tumorali, che può essere osservato sotto un microscopio. I numeri di cellulare delle cellule di morfologia e cancro possono essere valutati utilizzando campioni di TIC. Inoltre, l’estrazione del DNA genomico da campioni TIC può essere completato entro due giorni. Totale quantità e qualità di TIC DNA ottenuto utilizzando questo metodo era superiore a quella del DNA FFPE. Questo metodo rapido e semplice permette ai ricercatori per ottenere alta qualità DNA per test genetici (ad es., analisi di sequenziamento di prossima generazione, digital PCR e PCR quantitativa in tempo reale) e di abbreviare i tempi per riportare i risultati.
Introduction
Prossima generazione tecnologia di sequenziamento ha fornito i ricercatori significativi progressi nell’analisi delle informazioni sul genoma in variazioni genetiche, malattia mendeliana, predisposizione ereditaria e cancro 1,2,3 . Il Cancer Genome Atlas (TCGA) e International Cancer Genome Consortium (ICGC) hanno perseguito l’identificazione delle alterazioni genetiche in parecchi tipi di comuni tumori4. Centinaia di cancro essenziali driver geni è stati identificati correttamente, e alcune di queste molecole sono presi di mira per droga sviluppo1,5,6.
In ambito clinico, FFPE esemplari sono comunemente usati per la diagnosi patologica e la prova molecolare per varie malattie, compreso il cancro. Tuttavia, durante il processo di fissazione in formalina, cross-linking del DNA-proteine o DNA-DNA si verifica e viene indotta la frammentazione del DNA. Così, i campioni del DNA FFPE non sono sempre adatti per l’analisi genetica a causa della bassa qualità e la quantità di DNA7,8,9. Inoltre, ci vogliono diversi giorni per preparare i campioni FFPE e abilità tecnica è necessario preparare accuratamente le sezioni. Pertanto, è auspicabile sviluppare un metodo semplice e rapido per ottenere alta qualità DNA intatto.
La citologia è un metodo alternativo per la diagnosi patologica. Preparazione del campione citologico è un più semplice, meno costoso e più rapido approccio rispetto al FFPE preparazione10. La tecnica TIC è stata eseguita il linfonodo sentinella e marginali tessuti da pazienti di cancro al seno per la diagnosi rapida intraoperative per alcuni anni11,12. Tuttavia, ci sono pochi rapporti che hanno esaminato se il DNA genomic di alta qualità può essere estratto dai campioni TIC e utilizzato per la successiva analisi genetica. Campioni citologici sono comunemente macchiati con colorazione di Giemsa o di Papanicolaou (Pap), e precedentemente abbiamo segnalato che la quantità e la qualità del DNA estratto dagli esemplari TIC (soprattutto Giemsa-macchiata campioni) sono superiori a campioni ottenuti da FFPE tessuti13. Rispetto al Pap colorazione, colorazione Giemsa ha un vantaggio in che richiedono meno procedure di colorazione. In Pap colorazione, dopo i campioni sono stati fissati e macchiati, devono essere montati con montaggio medio (per esempio, Malinol) per distinguere i contenuti di esempio, come le cellule del tumore, le cellule normali e cellule infiammatorie sotto un microscopio. Se il campione di Pap è preparato senza la fase di montaggio, è quasi impossibile osservare le cellule al microscopio perché l’esemplare è asciugato. In confronto, colorazione Giemsa possono essere osservati nello stato secco, di conseguenza, il passo di montaggio non è necessario per la rapida valutazione cellulare. Per microdissezione, colorazione Giemsa è più adatto perché richiede campioni asciutti.
In questo rapporto, introduciamo un metodo semplice e rapido per preparare campioni TIC con colorazione Giemsa e dimostrare che il TIC è una fonte migliore per DNA rispetto agli esemplari FFPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo presentato un metodo alternativo per l’ottenimento del tumore del DNA da campioni patologici clinici utilizzando le TIC. Preparazione di TIC è molto semplice e richiede meno tempo rispetto ai metodi FFPE, senza la necessità di strumenti speciali10. Tutte le procedure dalla preparazione TIC per estrazione del DNA possono essere completate entro due giorni (Figura 1). Questo metodo riduce così il tempo di turnaround per test genetici. In par…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutto il personale medico ed accessorio dell’ospedale e i pazienti per acconsentire a partecipare. Si ringrazia Gabrielle White Wolf, PhD, dal gruppo di Esposito (www.edanzediting.com/ac) per la modifica di un progetto di questa relazione. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione per il progetto di ricerca del genoma della Prefettura di Yamanashi (Y.H. e modus operandi) e una sovvenzione da The YASUDA Medical Foundation (YH).
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
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