터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법
Summary
종양 조직에서 높은-품질 게놈 DNA를 얻는 유전 변경 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석 하기 위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포를 풍부 하 게 하 고 그대로 DNA 터치에서 인쇄물 세포학 표본 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.
Abstract
그것은 관리와 암 환자에 대 한 특정 분자 표적된 약의 치료 전에 암에서 mutational 상태를 결정 하는 중요 한입니다. 임상 설정에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 유전자 테스트를 위한 널리 사용 됩니다. 그러나, FFPE DNA는 일반적으로 손상 되 고 포 르 말린으로 고정 과정 조각. 따라서, FFPE DNA는 때로는 낮은 품질 및 수량 DNA의 유전자 검사에 적합 하지. 여기 우리가 터치 인쇄물 세포학 (TIC), 암 세포에서 게놈 DNA를 현미경으로 관찰 될 수 있는 방법 제시. 셀 형태 및 암 세포 숫자는 TIC 견본을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 또한, TIC 샘플에서 게놈 DNA 추출 2 이내에 완료할 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 얻은 TIC DNA의 품질과 총 FFPE DNA 보다 높았다. 이 신속 하 고 간단한 방법 연구를 결과 보고에 대 한 처리 시간을 단축 하 고 유전자 검사 (예를 들어, 다음 세대 시퀀싱 분석, 디지털 PCR 및 양적 실시간 PCR)에 대 한 높은-품질 DNA를 수 있습니다.
Introduction
차세대 시퀀싱 기술 제공 하고있다 연구팀은 유전자 변형, Mendelian 질병, 유전 경향, 및 암 1,2,3 게놈 정보 분석에 중요 한 발전 . 암 게놈 아틀라스 (TCGA) 및 국제 암 게놈 컨소시엄 (ICGC) 유전 변경 일반적인 암4의 여러 종류의 식별을 추구 했습니다. 수백 개의 필수 암 드라이버 유전자 성공적으로 확인 되었습니다, 그리고 이러한 분자의 일부 약물 개발1,,56타겟이 되고있다.
임상 설정에서 FFPE 표본 병 적인 진단과 분자 암 등 각종 질병에 대 한 테스트를 위해 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 포 르 말린으로 고정 과정 DNA-단백질 또는 DNA-DNA cross-linking과 DNA 파편을 유도. 따라서, FFPE DNA 샘플 적합 하지 않습니다 항상 유전자 분석에 대 한 낮은 질 및 양의 DNA7,,89. 또한, 고 기술 섹션을 정확 하 게 준비 해야 하는 FFPE 표본 준비를 몇 일 걸립니다. 따라서, 그것은 높은-품질 그대로 DNA를 얻기 위한 간단 하 고 빠른 방법을 개발 하는 것이 좋습니다.
세포학 병 적인 진단 위한 대체 방법입니다. Cytological 샘플 준비는 간단 하 게, 덜 FFPE 준비10에 비해 비싸고 더 빠른 접근 이다. TIC 기술 센 티 넬 림프절과 몇 년11,12자가 빠른 진단을 위해 유방암 환자에서 한계 조직에 수행 되었습니다. 그러나, TIC 표본에서 높은-품질 게놈 DNA를 추출할 수 있습니다 여부를 조사 하 고 후속 유전자 분석에 사용 되는 몇 가지 보고 있다. Cytological 표본은 일반적으로 물 들일 Papanicolaou (Pap) 또는 Giemsa 얼룩, 그리고 우리 이전 TIC 표본 (특히 Giemsa 얼룩이 샘플)에서 추출한 DNA의 품질과 양을 FFPE에서 얻은 샘플을 우수 하다는 것을 보고 조직13. Pap 얼룩과 비교, Giemsa 얼룩 장점이 덜 착 절차 요구에 있습니다. Pap 얼룩에 샘플 수정 되 고 스테인드, 후 그들은 해야 합니다 탑재할 종양 세포, 정상 세포를 현미경으로 염증 세포 등 샘플 내용을 구별을 위한 매체 (예, Malinol)를 장착. Pap 견본 설치 단계 없이, 준비 하는 경우 거의 불가능 한 표본은 건조 하기 때문에 현미경으로 세포를 관찰 하는 것 아니다. 비교에서는, Giemsa 얼룩 말린된 상태에서 관찰 될 수 있다, 그러므로, 설치 단계 빠른 세포 평가 위해 필요 하지 않습니다. 서, 대 한 Giemsa 얼룩은 더 적당 한 건조 표본 필요 하기 때문 에입니다.
이 보고서에서 우리 TIC 표본을 Giemsa 얼룩과 준비에 대 한 간단 하 고 빠른 방법을 소개 하 고 TIC가 더 나은 FFPE 표본에 비해 DNA에 대 한 설명.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서 우리는 콩을 사용 하 여 임상 병리학 표본에서 종양 DNA를 얻기 위해 다른 방법을 제시. TIC 준비는 매우 간단 하 고 특별 한 악기10에 대 한 요구 사항 없이 FFPE 방법에 비해 더 적은 시간이 필요. (그림 1) 2 이내 TIC 준비에서 DNA 추출에 모든 절차를 완료할 수 있습니다. 이 메서드는 따라서 유전자 검사를 수행 하기 위한 처리 시간이 줄어듭니다. 특…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 병원과 환자 들의 의료 및 보조 직원 참여 동의 감사. 우리는 가브리엘 화이트 울프,이 보고서의 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac)에서 박사 학위를 감사 합니다. 이 연구는 야마나시 현 (Y.H. 고 지)에서 게놈 연구 프로젝트와 부여에서는 야스다 의료 재단 (Y.H.)는 특정에 의해 지원 되었다.
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
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