Enkel og rask metode å få høy kvalitet svulst DNA fra klinisk-patologisk prøver bruker Touch forlaget cytologi
Summary
Få høykvalitets genomisk DNA fra tumor vev er et viktig første skritt for å analysere genetiske endringer med neste generasjons sekvensering. I denne artikkelen presenterer vi en enkel og rask metode for å berike kreftceller og få intakt DNA fra touch forlaget cytologi prøver.
Abstract
Det er viktig å bestemme mutational status i kreft før administrasjon og behandling av bestemte molekylær målrettet narkotika for kreftpasienter. I klinisk setting, er formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vev mye brukt for genetisk testing. FFPE DNA er imidlertid vanligvis skadet og fragmentert under fiksering prosessen med formalin. FFPE DNA er derfor noen ganger ikke tilstrekkelig for genetisk testing på grunn av lav kvalitet og mengde DNA. Her presenterer vi en metode for preg forlaget cytologi (TIC) få genomisk DNA fra kreftceller, som kan observeres under et mikroskop. Cellen morfologi og kreft cellen tallene kan evalueres ved hjelp TIC prøver. Videre kan utvinning av genomisk DNA fra TIC prøver fullføres innen to dager. Den totale mengden og kvaliteten på TIC DNA Hentet ved hjelp av denne metoden var høyere enn FFPE DNA. Denne raske og enkle metoden tillater forskere å få høy kvalitet DNA for genetisk testing (f.eks, neste generasjons sekvensering analyse, digital PCR og kvantitative sanntid PCR) og forkorte tiden det rapporterer resultater.
Introduction
Neste generasjons sekvensering teknologi har gitt forskerne betydelige fremskritt i å analysere genomet informasjon i genetisk variasjoner, Mendelian sykdom, arvelig predisposisjon og kreft 1,2,3 . Kreft genomet Atlas (TCGA) og International kreft genomet Consortium (ICGC) har forfulgt identifikasjon av genetiske endringer i flere typer vanlig kreft4. Hundrevis av viktige kreft driveren gener har blitt identifisert, og noen av disse molekylene er målrettet i narkotika utvikling1,5,6.
I klinisk setting brukes FFPE eksemplarer vanligvis for patologisk diagnose og molekylære testing for ulike sykdommer, inkludert kreft. Men under fiksering prosessen med formalin, DNA-protein eller DNA-DNA cross-linking oppstår og DNA fragmentering er indusert. Dermed er FFPE DNA-prøver ikke alltid egnet for genetisk analyse på grunn av lav kvalitet og mengde DNA7,8,9. Dessuten tar det flere dager å forberede FFPE eksemplarer, og tekniske ferdigheter er nødvendig for å forberede nøyaktig delene. Derfor er det ønskelig å utvikle en enkel og rask metode for å få høy kvalitet intakt DNA.
Cytologi er en alternativ metode for patologisk diagnose. Fargemaskin eksempel forberedelse er en enklere, mindre kostbare og rask tilnærming sammenlignet med FFPE forberedelser10. TIC teknikken er utført på sentinel lymfeknuter og marginale vev fra brystkreftpasienter for intraoperativ rask diagnose for noen år11,12. Det er imidlertid noen rapporter som har undersøkt om høy kvalitet genomisk DNA kan hentes fra TIC prøver og brukes for påfølgende genetisk analyse. Fargemaskin prøver er vanligvis farget med Papanicolaou (Pap) eller Giemsa flekker, og vi har tidligere rapportert at mengden og kvaliteten av DNA utvunnet fra TIC prøver (spesielt Giemsa-farget eksempler) er overlegen prøver innhentet fra FFPE vev13. Sammenlignet med Pap flekker, har Giemsa flekker en fordel til krever mindre flekker prosedyrer. I Pap flekker, når prøvene er fast og farget, må de være montert med montering medium (f.eksMalinol) for å skille eksempel innholdet, for eksempel kreftceller og normale celler inflammatoriske celler under et mikroskop. Hvis Pap prøven er utarbeidet uten montering trinn, er det nesten umulig å observere cellene under et mikroskop fordi prøven er tørket. Til sammenligning Giemsa flekker kan observeres i tørket staten, derfor montering trinnet er ikke nødvendig for rask mobilnettet evaluering. For microdissection er Giemsa flekker mer egnet fordi det krever tørr prøver.
I denne rapporten, vi introdusere en enkel og rask metode for å forberede TIC prøver med Giemsa flekker og vise at TIC er en bedre kilde til DNA sammenlignet med FFPE eksemplarer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien presenterte vi en alternativ metode for å få svulst DNA fra klinisk patologiske prøver med TIC. TIC forberedelse er svært enkel og trenger mindre tid sammenlignet med FFPE metoder, uten behovet for spesielle instrumenter10. Alle prosedyrer fra TIC forberedelse til DNA ekstraksjon kan fullføres innen to dager (figur 1). Denne metoden forkorter dermed tiden utføre genetisk testing. Spesielt, gir dette en betydelig fordel i forkortelsen antall dager…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle de medisinske og hjelpeutstyr ansatte på sykehuset og pasienter for samtykker i å delta. Vi takker Gabrielle White Wolf, PhD, fra Edanz gruppe (www.edanzediting.com/ac) for å redigere et utkast av denne rapporten. Denne studien ble støttet av en Grant-in-Aid for genom-forskningsprosjekt fra Yamanashi prefekturet (Y.H. og MO.) og stipend fra The YASUDA medisinske Foundation (Y.H.).
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer – Three Strikes and You’re Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
- Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
- Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
- Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
- Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
- Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
- Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
- Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
- Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
- Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
- Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
- Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
- Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
- Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).
