Простой и быстрый метод для получения высокого качества опухоли ДНК от клинических патологических образцов с помощью касания отпечаток цитологии
Summary
Получение высококачественных геномной ДНК опухолевых тканей является важным первым шагом для анализа генетических изменений, с помощью следующего поколения последовательности. В этой статье мы представляем простой и быстрый способ обогатить опухолевых клеток и получить нетронутыми ДНК от прикосновения отпечаток цитологии образцов.
Abstract
Важно, чтобы определить мутационного статуса в рак до администрации и лечения конкретных молекулярной целевых препаратов для больных раком. В клинических условиях, формалин Исправлена парафин врезанных тканей (FFPE) широко используются для генетического тестирования. Однако FFPE ДНК как правило повреждено и фрагментарный характер во время процесса фиксации с формалином. Таким образом FFPE ДНК иногда не достаточно для генетического тестирования из-за низкого качества и количества ДНК. Здесь мы представляем метод касания отпечаток цитологии (ИТК) для получения геномной ДНК от раковых клеток, которые можно наблюдать под микроскопом. Морфология и рак клеток числа клеток может оцениваться с помощью образцов TIC. Кроме того добыча геномной ДНК из TIC образцов может быть завершена в течение двух дней. Общее количество и качество TIC ДНК, полученные с помощью этого метода была выше, чем FFPE ДНК. Это быстрый и простой метод позволяет исследователям для получения высокого качества ДНК генетического тестирования (например, следующего поколения последовательности анализа, цифровой ПЦР и Количественная ПЦР в реальном времени) и сократить сроки для представления результатов.
Introduction
Следующее поколение технологии виртуализации предоставил исследователи значительных достижений в анализе генома информации в генетических вариаций и Менделевское болезни, наследственная предрасположенность, рака 1,2,3 . Атлас генома рака (TCGA) и международного консорциума рака генома (ICGC) проводил выявление генетических изменений в нескольких типов общих рака4. Сотни основных Рак генов драйвера были успешно выявлены, и некоторые из этих молекул предназначены для наркотиков развития1,5,6.
В клинических условиях, образцы FFPE часто используются для диагностики патологических и молекулярных тестирования для различных заболеваний, включая рак. Однако во время процесса фиксации с формалином, ДНК белковых или ДНК-ДНК cross-linking возникает и фрагментацию ДНК индуцируется. Таким образом образцы ДНК FFPE не всегда подходит для генетического анализа из-за низкого качества и количества ДНК7,8,9. Кроме того она занимает несколько дней, чтобы подготовить FFPE образцы, и технические навыки необходимо подготовить точно в разделах. Таким образом желательно разработать простой и быстрый метод для получения высокого качества нетронутыми ДНК.
Цитология является альтернативный метод для диагностики патологии. Цитологические пробоподготовки является более простой, менее дорогим и более быстрый подход по сравнению с FFPE подготовка10. ТИЦ техника была выполнена на дозорных лимфатические узлы и маргинальных тканей от больных раком молочной железы для интраоперационного быстрой диагностики для11,несколько лет12. Однако есть несколько докладов, которые изучили ли высокое качество геномной ДНК могут быть извлечены из образцов ТИЦ и используется для последующего генетического анализа. Цитологические образцов обычно окрашивали Папаниколау (Пап) или окрашивание Гимза, и мы ранее сообщали, что количество и качество ДНК, извлеченные из образцов TIC (особенно пятнами Гимза образцы) превосходят образцы, полученные из FFPE 13тканей. По сравнению с Pap окрашивание, Гимзы окрашивание имеет преимущество в требующих менее окрашивание процедур. В Пап окрашивание, после того, как образцы были исправлены и витражи, они должны устанавливаться с монтажными среднего (например, Malinol) для разграничения содержимое образца, например клетки тумора, нормальные клетки и воспалительных клеток под микроскопом. Если ППА образец подготовлен без монтажа шаг, это почти невозможно наблюдать клетки под микроскопом, потому что высушенный образец. В сравнении Гимзы окрашивания можно наблюдать в состояние сушеных, поэтому монтаж шаг не является необходимым для быстрой сотовой оценки. Для microdissection Гимзы окрашивание является более подходящим, потому что он требует сухих образцов.
В настоящем докладе мы представляем простой и быстрый метод для подготовки TIC образцов с Гимза окрашивание и продемонстрировать, что ТИЦ является лучшим источником для ДНК, по сравнению с FFPE образцами.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы представили альтернативный метод для получения опухоли ДНК от клинических патологических образцов, используя TIC. ТИЦ подготовка очень проста и требует меньше времени по сравнению с FFPE методами, без требования для специальных инструментов10. Все проц?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех медицинских и вспомогательных сотрудников больницы и пациентов за согласие участвовать. Мы благодарим Габриэль белый волк, PhD, Edanz группы (www.edanzediting.com/ac) для редактирования проекта настоящего доклада. Это исследование было поддержано субсидий для исследовательского проекта генома из префектуры Яманаси (Y.H. и М.О) и Грант от ЯСУДА медицинский фонд (Y.H.).
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer – Three Strikes and You’re Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
- Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
- Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
- Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
- Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
- Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
- Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
- Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
- Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
- Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
- Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
- Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
- Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
- Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).
