Bu el yazması oksidatif stres xenobiotic kaynaklı incelenmesi için genetik olarak kodlanmış fluorogenic gazetecilere canlı hücre görüntüleme bir uygulamada kullanımını açıklar. Bu deneysel yaklaşım eşsiz kronolojik zamanmekansal çözünürlük, duyarlılık ve özgüllük eksiklikleri toksikolojik oksidatif stres tespiti için kullanılan geleneksel yöntemlerden birçoğu kaçınırken sunmaktadır.
Oksidatif stres sık atıf toksikolojik mekanizması olmakla birlikte, eksiklikleri, örnek, potansiyel eserler getirilmesi ve özgüllük reaktif için eksikliği de dahil olmak üzere bir dizi üzerinde çalışmak için geleneksel yöntemler muzdarip türler dahil. Böylece, gözlemlemek ve hücre içi Redoks tedirginlikler, daha yaygın olarak anılacaktır oksidatif stresi ölçmek için kullanılan non-yıkıcı, hassas ve belirli yöntemleri için toksikoloji alanında geçerli bir ihtiyaç vardır. Burada, iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri, roGFP2 ve HyPer canlı hücre görüntüleme çalışmaları xenobiotic kaynaklı oksidatif yanıt-e doğru gözlemek için kullanılmak üzere, kullanımlar için bir yöntem mevcut. roGFP2 Sakinleştiği glutatyon Redoks ile potansiyel (EGSH), HyPer doğrudan hidrojen peroksit (H2O2) algılar. Her iki sensörleri çeşitli hücre tiplerinin transfection veya iletim yoluyla içine ifade ve belirli hücresel kompartmanlarda hedeflenebilir. En önemlisi, bu sensörler kullanarak live-cep mikroskobu geleneksel yöntemlerle mümkün değildir yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük sunar. Floresan yoğunluğu göstergesi için sırayla 404 tarafından heyecanlı zaman her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörler olarak 510 nm hizmet izlenen değişiklikleri nm ve 488 nm ışık. Bu özellik her iki sensörler ratiometric, ortak mikroskobu eserler ortadan kaldırmak ve sensör ifade hücreleri arasındaki farklılıkları için düzeltme yapar. Bu metodoloji Fluorometrik platformlarda confocal görüntüleme sistemleri, geleneksel geniş alanlı mikroskobu ve plaka ile kullanıma uygun yapım o reçete dalga boylarında, heyecan verici ve toplama emisyonlarının yetenekli genelinde uygulanabilir okuyucular. Her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri hücre tipleri ve toksikolojik çalışmalar çeşitli hücresel EGSH ve H2O2 nesil gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılır. Burada özetlenen Fluorometrik platformları için roGFP2 ve HyPer uygulama live-hücre toksikolojik Değerlendirmeler oksidatif stres ve hücre tipleri arasında yaygın olarak uyarlanabilir standart bir yöntemdir.
“Oksidatif stres” sık sık toksikoloji, bir mekanizma olarak gösterildi henüz nadiren terimdir bu terimi özellikle açıklanmıştır. Oksidatif stres Reaktif oksijen türleri, antioksidan moleküllerin oksidasyonu serbest radikallerin neden olduğu hasar nesil de dahil olmak üzere birkaç hücre içi işlemler için başvuruda bulunabilir ve belirli sinyal bile aktif basamaklandırır. Oksidatif stres ya da doğrudan eylem tarafından xenobiotic tesisin5 ikna etmek için belgelenen çevre kirletici1,2 ve ilaç ajanlar3,4 geniş bir yelpazesi ,6 veya ikincil olarak hücresel yanıt7,8,9,10parçası olarak oksidan türlerin üretimi. Bu nedenle doğru gözlemlemek ve olumsuz sonuçlara yol önde gelen oksidatif süreçleri karakterize toksikoloji büyük ilgi. Oksidatif stres ölçme geleneksel yöntemlerle oksitlenmiş biomolecules11,12,13,14,15 veya antioksidan16 kimliği içerir ,17,18,19,20veya reaktif türler kendilerini21,22,23, doğrudan ölçümü 24. Ancak, bu yöntemler genellikle kez örnek tüketir, Uzaysal çözünürlük ortadan kaldırır ve potansiyel olarak eserler25tanıştırmak hücresel bozulma, gerektirir. Oksidan türler tespiti ve oksidatif stres işaretleri için daha hassas ve belirli yöntem geliştirme genel olarak xenobiotic maruz kalma yan etkilerinin incelenmesi için geçerlidir.
Yeni nesil fluorogenic genetik olarak kodlanmış sensörleri kullanarak live-cep mikroskobu canlı hücreler hücre içi Redoks durumunun izlenmesi için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu sensörler genellikle bir vektör transfection veya iletim yöntemleri ile tanıtılan bir viral organizatörü kontrol altında kullanarak ifade edilir. Floresan sensör ifade hücreleri kolayca görsel olarak tanımlanabilir beri yüksek ifade verimliliği gerekli değildir. Toksikolojik değerlendirmeler için gerçek zamanlı olarak xenobiotic bileşikler maruz Floresans mikroskobu kullanılarak bu sensörler ifade hücreleri görülebilir. Bu deneysel tasarım aynı hücrede tekrarlanan ölçümler her hücrenin kurulan temel kendi kontrolü hareket etmeye izin verir. Canlı hücre görüntüleme tarafından tanınan yüksek zamansal çözünürlük oksidatif olaylar, özellikle de mütevazı büyüklüğü veya geçici doğada algılanması için çok uygundur. Hassas ve belirli hedef molekülleri olmasının yanı sıra, bazı bu sensörler Floresans iki dalga boylarında ışık kullanarak heyecanlı. Bu olay bu sensör ifade, hücre kalınlığı, lamba değişimleri gibi eserler nedeniyle gelen otantik sensör yanıtları ile ilişkili sinyal değişiklikleri muhakeme izin veren bir oranı olarak ifade edilecek floresan emisyon izin verir. yoğunluğu, photobleaching ve duyarlılık Floresans dedektörü26. Fluorogenic sensörleri kullanımı bir diğer avantajı onlar için geleneksel yöntemler25,26,27tarafından eşsizdir Uzaysal çözünürlük düzeyi oluşturulmasını belirli hücresel kompartmanlarda yönlendirilebilir değil.
Yeşil flüoresan protein (GFP) göre genetik olarak kodlanmış sensörler büyük bir ailenin geliştirilmiş ve fizyolojik işaretleri, pH, sıcaklık, kalsiyum konsantrasyonu ve ATP/ADP oranı25 de dahil olmak üzere geniş bir çeşitlilik üzerindeki raporunda karakterize ,28,29,30,31. Bunlar arasında glutatyon Redoks potansiyeli (EGSH) ve hidrojen peroksit (H2O2) sensörler bulunmaktadır. Bu sensörler Redoks Biyoloji ve Tıp uygulamaları için geliştirilen iken, onlar da oksidatif stres xenobiotic kaynaklı çalışmaya adapte olmuştur. Özellikle, burada özetlenen Protokolü EGSH sensör roGFP2 ve H2O2 sensör HyPer kullanımını açıklar.
roGFP2 hücre içi azaltılmış ve okside glutatyon (GSH/GSSG) glutatyon peroksidaz (GPx), glutaredoxin (Grx) ve glutatyon redüktaz ilgili bir Redoks röle aracılığıyla Redoks potansiyeli (GR) (Resim 1)25, raporlar 32 , 33. glutatyon baskın hücresel antioksidan moleküldür ve öncelikle haliyle azaltılmış (GSH) sitozol25,34millimolar konsantrasyonlarda bulunur. EGSH işlev herhangi bir sonuca bağlı olmayan ise, hücre içi oksidatif durumu34önemli bir göstergesi olarak kabul edilmektedir. GSSG konsantrasyonu nispeten küçük bir artış roGFP2 tarafından tespit EGSH artış sonuçlanır. Aynı derecede önemli, EGSH izleme xenobiotic pozlama sırasında roGFP2 kullanarak potansiyel olarak çok Redoks röle birkaç noktada etki mekanizması hakkında ortaya çıkarabilir ve Pentoz fosfat gibi ilişkili yollar (Resim 1 şönt )35. Burada tartışılan ikinci sensör, HyPer, bu sarı floresan protein (YFP) ekleme bakteriyel H2O2düzenleyici etki alanına türetilmiş hücre içi bir H2O2 sonda-hassas transkripsiyon OxyR136faktör. Her ne kadar bu daha önce zarar verici bir Reaktif oksijen ara olarak kabul edilmiştir, H2O2 giderek önemli bir hücre içi sinyal molekülü fizyolojik şartlarda37, altında olarak tanınır H2O2 için tanınmayan rolleri toksikoloji de bulunduğunu öne 38. Örneğin, aşırı H2O2 xenobiotic bir poz tarafından indüklenen hücresel sinyal veya bioenergetics bir kayma bozukluk habercisi olabilir.
Her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri insan epidermoid Karsinomu hücre kültürünü A431 ve BEAS-2B EGSH ve H2 değişiklikleri gözlemlemek için insan bronş epitel hücre satırı da dahil olmak üzere birçok kurulan hücre hatlarında ifade edilmiştir O2 toksikolojik Etkilenmeler çeşitli yanıt olarak. Bunlar gaz halinde olan yakıtlar kirleticiler (ozon35), Partiküler madde (1,2 naphthoquinone39,40 ve çinko41) ve nikel nano tanecikleri (yayınlanmamış veri) çözünür bileşenler içerir. Bu çalışmalar bu iki sensörler olası uygulamaları yalnızca küçük bir bölümünün temsil eder. Teorik olarak, alma ve DNA’sı bu sensörler geleneksel moleküler biyoloji teknikleri ile ifade etme özelliği olan herhangi bir hücre tipi hücresel oksidatif durumu değiştirmek için şüpheli xenobiotics etkilerini değerlendirmek için yararlı olabilir. Bugüne kadar bir veya daha fazla bu sensörlerin ifade çeşitli prokaryot ve Ökaryotlar, dahil birçok memeli, bitki, bakteri ve Maya hücre türleri25,26,36,42edilmiştir. Göstergesi EGSH ve H2O2 sensörleri için 510 yayılan floresan yoğunluğu bir değişimdir nm uyarma ile 488 ve 404 nm ışık üzerine. Bu yöntem mikroskobu (confocal ve geniş alanlı) ve plaka okuyucu türleri dahil olmak üzere Fluorometrik platformda yaygın olarak adapte olur. Burada sunulan yöntemi duyarlı ve spesifik hücre içi EGSH ve H2müşahede vitro toksikolojik sistemlerinde O2 sağlar.
İçinde hafiye değişiklikler hücre içi EGSH ve H2O2, sırasıyla, roGFP2 ve HyPer kullanımı önceki fizyolojik ve toksikolojik çalışmalar 25,35,36 iyi tarif olmuştur ,39,40,41,42,43. Burada özetlenen Protokolü …
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar deneysel tasarım ve el yazması düzenlemeleri konusunda yardım almak için Katelyn Lavrich teşekkür etmek istiyorum.
roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |