Imagerie des approches pour les évaluations toxicologiques stress oxydatif, à l’aide de capteurs codés génétiquement fluorogène

Summary

Ce manuscrit décrit l’utilisation de reporters fluorogène génétiquement encodé dans une application de l’imagerie de cellules vivantes pour l’examen du stress oxydatif induit par les xénobiotiques. Cette approche expérimentale offre inégalée de résolution spatio-temporelle, sensibilité et spécificité tout en évitant beaucoup des défauts des méthodes conventionnelles utilisées pour la détection du stress oxydatif toxicologique.

Abstract

Alors que le stress oxydatif est un mécanisme toxicologique souvent cité, les méthodes conventionnelles de l’étudier souffrent d’un certain nombre de lacunes, y compris la destruction de l’échantillon, introduction d’éventuels artefacts et un manque de spécificité pour les réactifs espèce en cause. Ainsi, il y a un besoin actuel dans le domaine de la toxicologie pour les méthodes non destructives, sensibles et spécifiques qui peut être utilisé pour observer et quantifier les perturbations redox intracellulaire, plus communément appelée stress oxydatif. Nous présentons ici une méthode pour l’utilisation de deux capteurs codés génétiquement fluorogène, roGFP2 et HyPer, à être utilisés dans les études d’imagerie de cellules vivantes pour observer les réponses oxydatifs induites par des xénobiotiques. roGFP2 s’équilibre avec le potentiel redox de glutathion (_GSHde E), tandis que l’HyPer détecte directement le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂). Les deux capteurs peuvent être exprimées en divers types cellulaires par transfection ou par transduction et peuvent être ciblées à des compartiments cellulaires spécifiques. Surtout, microscopie de cellules vivantes à l’aide de ces capteurs offre haute résolution spatiale et temporelle qui n’est pas possible en utilisant des méthodes conventionnelles. Changements dans l’intensité de fluorescence mesuré à 510 nm sert comme la lecture pour les deux capteurs codés génétiquement fluorogène lorsqu’il est excité séquentiellement par 404 nm et 488 nm lumière. Cette propriété en fait les deux capteurs ratiométrique, éliminant les artéfacts communs de microscopie et de correction des différences dans l’expression de la sonde entre les cellules. Cette méthodologie peut être appliquée à travers une variété de plates-formes fluorimétrique capables d’émissions passionnantes et collecteurs dans les longueurs d’onde prescrites, ce qui convient pour une utilisation avec des systèmes d’imagerie confocale, microscopie à champ large conventionnelle et la plaque lecteurs. Les deux capteurs codés génétiquement fluorogène ont été utilisés dans une variété de types de cellules et les études toxicologiques pour surveiller les cellulaires E_BA et H₂O₂ production en temps réel. Présentée ici est une méthode normalisée qui est largement adaptable sur des plates-formes fluorimétrique pour l’application des roGFP2 et HyPer en cellules vivantes les évaluations toxicologiques du stress oxydatif et les types de cellules.

Introduction

Pourtant, le terme « stress oxydatif » est souvent cité comme un mécanisme en toxicologie, est rarement ce terme décrit plus précisément. Le stress oxydatif peut faire référence à plusieurs processus intracellulaires, y compris la production d’espèces réactives de l’oxygène, dommages causés par les radicaux libres, l’oxydation des molécules antioxydantes, et même l’activation de la signalisation spécifique des cascades. Un large éventail de contaminants environnementaux^1,2 et agents pharmaceutiques^3,4 ont été documentés pour induire un stress oxydatif par une action directe du composé xénobiotique^{5 ,6} ou secondairement par la production d’espèces oxydantes dans le cadre d’une réponse cellulaire^7,8,9,10. Il est donc d’un grand intérêt en toxicologie d’observer avec précision et de caractériser les processus oxydatifs conduisant à des résultats indésirables. Les méthodes classiques de mesure du stress oxydatif impliquent identification des biomolécules oxydé^{11,12,13,14,15} ou antioxydants^{16 ,17,18,19,20}, ou mesure directe d’espèces réactives elles-mêmes^{21,22,23, 24}. Cependant, ces méthodes nécessitent des perturbations cellulaires, qui consomment souvent l’échantillon, élimine la résolution spatiale et potentiellement présente des artefacts²⁵. Le développement de méthodes plus sensibles et spécifiques pour la détection d’espèces oxydantes et marqueurs de stress oxydatif est largement applicable à l’enquête sur les effets néfastes de l’exposition xénobiotique.

Microscopie de cellules vivantes à l’aide d’une nouvelle génération de capteurs codés génétiquement fluorogène a émergé comme un outil puissant pour surveiller l’état redox intracellulaire des cellules vivantes. Ces capteurs sont généralement exprimées à l’aide d’un vecteur sous le contrôle d’un promoteur viral qui est introduit par l’intermédiaire de méthodes de transfection ou transduction. Efficacité de haute expression n’est pas nécessaires, étant donné que les cellules exprimant la sonde fluorescente peuvent être facilement identifiés visuellement. Pour les évaluations toxicologiques, les cellules exprimant ces capteurs peuvent être observés à l’aide de la microscopie en fluorescence, car ils sont exposés à des composés xénobiotiques en temps réel. Ce dispositif expérimental permet des mesures répétées dans la même cellule, permettant ainsi la base établie de chaque cellule servir son propre contrôle. La résolution temporelle élevée accordée par imagerie de cellules vivantes est bien adaptée pour la détection des événements oxydatifs, particulièrement ceux qui sont modestes en amplitude ou transitoires dans la nature. En plus d’être sensible et spécifique à leurs molécules cibles, la fluorescence de certains de ces capteurs peut être excitée en utilisant deux longueurs d’onde de la lumière. Ce phénomène permet l’émission fluorescente s’exprimer sous forme d’un rapport qui permet le discernement des modifications de signal associé à réponses authentiques capteur de ceux causés par des objets tels que des variations dans l’expression de capteur, épaisseur de la cellule, lampe intensité, photobleaching et la sensibilité du détecteur fluorescence²⁶. Un autre avantage de l’utilisation de capteurs fluorogène est qu’ils peuvent être ciblés pour les compartiments cellulaires spécifiques, la création d’un niveau de résolution spatiale qui est inégalée par les méthodes conventionnelles de^26,25,27.

Une grande famille de capteurs codés génétiquement basés sur la protéine fluorescente verte (GFP) ont été développés et caractérisés à ce rapport sur un grand nombre de marqueurs physiologiques, y compris le pH, la température, concentrations de calcium et le rapport ATP/ADP^{25 ,28,29,30,31}. Parmi ceux-ci sont des capteurs de la glutathion le potentiel redox (E_BA) et le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂). Alors que ces capteurs ont été développés pour des applications en biologie de l’oxydo-réduction et de la physiologie, ils ont également été adaptés pour étudier le stress oxydatif induit par les xénobiotiques. Plus précisément, le protocole décrit ici décrit l’utilisation de la roGFP2 de capteur E_BA et le capteur de₂ H₂O HyPer.

roGFP2 des rapports sur le potentiel redox de glutathion intracellulaire réduit et oxydé (GSH/GSSG) via un relais d’oxydo-réduction impliquant la glutathion peroxydase (GPx), glutarédoxine (Grx) et la glutathion réductase (GR) (Figure 1)^{25, 32 , 33}. glutathion est l’antioxydant cellulaire prédominante molécule et est présente principalement dans sa forme réduite (GSH) à des concentrations millimolaires dans le cytosol^25,34. Alors que E_BA n’a pas été liée à n’importe quel résultat fonctionnel, elle est reconnue comme un important indicateur de statut oxydatif intracellulaire³⁴. Une augmentation relativement faible de la concentration de GSSG entraîne une augmentation en E_BA qui est détectable par roGFP2. Tout aussi important, suivi de E_BA à l’aide de roGFP2 au cours d’expositions xénobiotiques peut potentiellement révéler beaucoup sur le mécanisme d’action à plusieurs reprises dans le relais de l’oxydo-réduction et les voies associées, tels que le phosphate de pentose shunt (Figure 1 )³⁵. Le second capteur discuté ici, HyPer, est une intracellulaire H₂O₂ sonde dérivée de l’insertion de la protéine fluorescente jaune (YFP) dans le domaine réglementaire bactérienne H₂O₂-transcription sensible facteur OxyR1³⁶. Bien qu’il a été considérée une oxygénées nuisibles intermédiaire, H₂O₂ n’est plus en plus reconnu comme une molécule de signalisation intracellulaire importante sous des conditions physiologiques^{37, 38}, ce qui suggère que les rôles non reconnus pour H₂O₂ existent en toxicologie ainsi. Par exemple, excès H₂O₂ induite par une exposition xénobiotique pourrait être un précurseur du dérèglement dans la signalisation cellulaire ou d’un changement dans la bioénergétique.

Les deux capteurs codés génétiquement fluorogène ont été exprimés dans plusieurs lignées cellulaires établies, dont la lignée de cellules de carcinome épidermoïde humain A431 et la ligne de cellules épithéliales bronchiques humaines BEAS-2 b, pour observer les changements E_BA et H₂ O₂ en réponse à une variété d’expositions toxicologiques. Il s’agit de gaz polluants (ozone,³⁵), des composants solubles de particules (1,2 naphtoquinone^39,40 et zinc⁴¹) et de nanoparticules de nickel (données non publiées). Ces études représentent seulement un petit sous-ensemble des applications possibles de ces deux capteurs. En théorie, n’importe quel type de cellule qui est capable de recevoir et d’exprimer l’ADN de ces capteurs grâce à des techniques classiques de biologie moléculaire peut être utilisé pour évaluer les effets des xénobiotiques soupçonnés d’altérer l’état oxydatif cellulaire. A ce jour, un ou plusieurs de ces capteurs a été exprimée dans divers procaryotes et eucaryotes, y compris plusieurs mammifères, plantes, bactéries et levure cellule types^25,26,36,42. L’affichage pour les E_BA et H₂O₂ capteurs est un changement dans l’intensité de la fluorescence émise à 510 nm à excitation à 488 et 404 nm. Cette méthode est largement adaptable sur plates-formes fluorimétrique, comme divers types de microscopie (confocale et grand champ) et des lecteurs de plaques. La méthode présentée ici permet une observation sensible et spécifique d’intracellulaire E_BA et H₂O₂ dans les systèmes de toxicologiques in vitro .

Protocol

1. préparation des cellules Remarque : Cette procédure décrit la transduction des gènes d’une lignée de cellules immortalisées (BEAS-2 b ; ATCC, Manassas, VA) pour exprimer le journaliste désiré (roGFP2 ou HyPer). Autres lignes/types de cellules ou les méthodes de transfert de gènes, y compris de transfection, peuvent être utilisés tant qu’ils résultent en un niveau d’expression du journaliste adéquate pour visualiser un nombre suffisant de cellules exprimant le capteur / c…

Representative Results

L’utilisation de roGFP2 et HyPer dans la détection de changements dans EBA et intracellulaire H2O2 a été bien décrite précédemment25,36,42,43 et est démontré ici. Images confocales de cellules exprimant roGFP2 au départ et addition suivante de H2O2 et sur la TNT sont indiquées à la <strong class…

Discussion

L’utilisation de roGFP2 et HyPer en détectant les changements en intracellulaire E_BA et H₂O₂, respectivement, a été bien décrite dans les précédentes études physiologiques et toxicologiques ^{25,35,36 ,39,40,41,42,43}…

Materials

roGFP2 Plasmid	University of Oregon	N/A	Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid	Evrogen	FP941
Hydrogen Peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	10708984001
9,10-Phenanthrenequinone	Sigma Aldrich	156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes	Ted Pella	14029-20
BEAS-2B cell line	American Type Culture Collection	CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium	Lonza	192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit	Lonza	192060
Excel	Microsoft Office Suite	N/A
NIS-Elements AR Imaging Software	Nikon	N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System	Nikon	N/A