التصوير النهج لإجراء تقييمات للسمية الأكسدة باستخدام أجهزة استشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا

Summary

هذه المخطوطة يصف استخدام الصحفيين فلوروجينيك ترميز وراثيا في تطبيق التصوير خلية يعيش لدراسة الأكسدة الناجمة عن إكسينوبيوتيك. ويوفر هذا النهج التجريبي القرار الزمانية المكانية لم يسبق لها مثيل، وحساسية، وخصوصية مع تجنب العديد من أوجه قصور الأساليب التقليدية المستخدمة للكشف عن الأكسدة السمية.

Abstract

بينما الأكسدة إليه سمية يكثر ذكرها، الأساليب التقليدية للدراسة فإنه يعاني من عدد من أوجه القصور، بما في ذلك تدمير للعينة، والأخذ بالنتائج الملموسة المحتملة، وعدم وجود خصوصية لرد الفعل الأنواع المعنية. ومن ثم، هناك حاجة الحالية في مجال علم السموم للأساليب غير المدمرة وحساسة ومحددة التي يمكن استخدامها لمراقبة وقياس الاضطرابات الأكسدة داخل الخلايا، أكثر شيوعاً المشار إليها الأكسدة. وهنا نقدم طريقة لاستخدام اثنين من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا، roGFP2 وفرط، لاستخدامها في الدراسات خلية يعيش التصوير لمراقبة ردود الأكسدة الناجمة عن إكسينوبيوتيك. roGFP2 اكويليبراتيس مع الجلوتاثيون الأكسدة المحتملة (ه_{المدفع جريازيف})، بينما فرط مباشرة بالكشف عن فوق أكسيد الهيدروجين (H₂O₂). يمكن التعبير عنها في مختلف أنواع الخلايا عن طريق تعداء أو توصيل كل من أجهزة الاستشعار، ويمكن أن تكون مستهدفة لمقصورات الهاتف الخلوي محددة. الأهم من ذلك، يوفر الفحص المجهري خلية يعيش باستخدام أجهزة الاستشعار هذه عالية الدقة المكانية والزمانية التي ليس من الممكن استخدام الأساليب التقليدية. التغيرات في كثافة fluorescence رصدها في 510 نانومتر يخدم كقراءات لكل فلوروجينيك ترميز وراثيا من أجهزة الاستشعار عند التتابع ولع 404 نانومتر و 488 نانومتر الضوء. هذه الخاصية تجعل كلا راتيوميتريك أجهزة الاستشعار، القضاء على الشائعة مجهرية التحف وتصحيح الاختلافات في التعبير الاستشعار بين الخلايا. ويمكن تطبيق هذه المنهجية عبر مجموعة متنوعة من منصات فلوروميتريك قادرة على انبعاثات مثيرة وجمع موجية المنصوص عليها، يجعلها مناسبة للاستخدام مع أنظمة التصوير [كنفوكل] والتقليدية واسع المجال المجهري، ولوحة القراء. استخدمت كل من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، والدراسات السمية لمراقبة الهاتف الخلوي ه_{المدفع جريازيف} والجيل_{2 2}س ح في الوقت الحقيقي. المبين هنا هو أسلوب موحد قابل للتكيف على نطاق واسع عبر أنواع الخلايا ومنصات فلوروميتريك لتطبيق roGFP2 وفرط في خلية يعيش تقييمات السمية للأكسدة.

Introduction

بعد مصطلح “الأكسدة” كثيرا ما يشار إليه في علم السموم، ونادراً ما هو هذا المصطلح هو موضح على وجه التحديد. الأكسدة ويمكن الرجوع إلى العديد من العمليات داخل الخلايا، بما في ذلك توليد الأنواع الأكسجين التفاعلية، والأضرار الناجمة عن الجذور الحرة، أكسدة الجزيئات المضادة للأكسدة، والشلالات حتى تفعيل إشارات محددة. وقد وثقت طائفة واسعة من الملوثات البيئية^1،2 و^3،وكلاء الدوائية⁴ لحفز الأكسدة أما العمل المباشر لمجمع إكسينوبيوتيك نفسها^{5 ،6} أو ثانوي بإنتاج أنواع الأكسدة كجزء من الاستجابة الخلوية^7،،من^89،10. ولذلك، من مصلحة كبيرة في علم السموم التقيد بدقة وتميز في عمليات الأكسدة مما يؤدي إلى نتائج سلبية. الأساليب التقليدية لقياس الأكسدة تنطوي على تحديد الجزيئات الحيوية المؤكسد^11،،من^1213،،من¹⁴¹⁵ أو المواد المضادة للأكسدة^{16 ،،}من^1718،،من¹⁹²⁰، أو القياس المباشر للأنواع المتفاعلة أنفسهم^21،،من^{2223، 24}. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق عادة انقطاع الهاتف الخلوي، الذي كثيرا ما يستهلك العينة، ويلغي القرار المكانية ويحتمل أن يقدم التحف²⁵. تطوير أساليب أكثر حساسية وتحديداً للكشف عن أنواع الأكسدة وعلامات للأكسدة قابل للتطبيق على نطاق واسع للتحقيق في الآثار السلبية للتعرض إكسينوبيوتيك.

خلية يعيش مجهرية باستخدام جيل جديد من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا برز كأداة قوية لرصد حالة الأكسدة داخل الخلية من الخلايا الحية. عادة ما يعبر عن هذه المجسات باستخدام ناقل تحت سيطرة أحد المروجين الفيروسية التي يتم تقديمها عن طريق منهجيات تعداء أو توصيل. التعبير عالية الكفاءة ليست ضرورية، نظراً للخلايا معربا عن استشعار الفلورسنت يمكن بسهولة تحديد بصريا. لتقييمات السمية، يمكن ملاحظة معربا عن أجهزة الاستشعار هذه الخلايا باستخدام مجهر الأسفار كما أنهم يتعرضون لمركبات إكسينوبيوتيك في الوقت الحقيقي. ويسمح هذا التصميم التجريبي القياسات المتكررة في نفس الخلية، مما يتيح الأساس أنشئت كل خلية بمثابة عنصر التحكم الخاص به. عالية الدقة الزمنية الممنوحة بتصوير خلية يعيش مناسبة تماما للكشف عن أحداث الأكسدة، خاصة تلك التي تعتبر متواضعة في حجمها أو عابرة في الطبيعة. بالإضافة إلى كونها حساسة ومحددة سواء لتلك الجزيئات المستهدفة، يمكن متحمس الأسفار بعض أجهزة الاستشعار هذه باستخدام اثنين من الأطوال الموجية للضوء. يسمح هذا الظاهرة انبعاث الفلورسنت يمكن التعبير عنها كنسبة، مما يسمح بتمييز التغييرات إشارة المرتبطة باستجابات استشعار أصيلة من تلك الناجمة عن المصنوعات اليدوية مثل الاختلافات في التعبير الاستشعار، وسمك الخلية، مصباح كثافة، فوتوبليتشينج، وحساسية الكاشف ومضان²⁶. وهناك ميزة أخرى لاستخدام أجهزة الاستشعار فلوروجينيك هو أن أنها يمكن أن تكون مستهدفة لمقصورات الهاتف الخلوي محددة، إنشاء مستوى القرار المكانية التي لا مثيل لها بالطرق التقليدية^25،،من²⁶²⁷.

وضعت عائلة كبيرة من أجهزة الاستشعار وراثيا ترميز استناداً إلى البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) وتتميز بتقرير عن مجموعة متنوعة واسعة من العلامات الفيزيولوجية، بما في ذلك درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وتركيزات الكالسيوم، ونسبة ATP/ADP^{25 ،،}من^2829،،من³⁰³¹. وشملت من بين هذه مجسات الجلوتاثيون الأكسدة المحتملة (ه_{المدفع جريازيف}) وفوق أكسيد الهيدروجين (H₂O₂). في حين وضعت أجهزة الاستشعار هذه التطبيقات في الأكسدة والاختزال علم الأحياء وعلم وظائف الأعضاء، كانت أيضا تكييف لدراسة الأكسدة الناجمة عن إكسينوبيوتيك. على وجه التحديد، يصف البروتوكول الواردة هنا استخدام roGFP2 الاستشعار الإلكترونية_{المدفع جريازيف} وأجهزة الاستشعار_{2 2}س ح فرط.

roGFP2 تقارير بشأن إمكانيات الأكسدة داخل الخلايا الجلوتاثيون مخفضة والمؤكسدة (المدفع جريازيف/جسج) عن طريق تتابع الأكسدة والاختزال التي تنطوي على الجلوتاثيون البيروكسيديز (GPx) وجلوتاريدوكسين (جركس) ريدكتيز الجلوتاثيون (GR) (الشكل 1)^{25، 32 , 33}-الجلوتاثيون هو جزيء المضادة للأكسدة الخلوية الغالبة وهي موجودة أساسا في شكل انخفاض (المدفع جريازيف) تركيزات ميليمولار في^25،سيتوسول³⁴. بينما ه_{المدفع جريازيف} لا ترتبط أي نتائج وظيفية، من المسلم كمؤشر هام على حالة الأكسدة داخل الخلايا³⁴. زيادة صغيرة نسبيا في تركيز جسج يؤدي إلى زيادة في ه_{المدفع جريازيف} التي يمكن كشفها بواسطة roGFP2. المثل الهامة، رصد ه_{المدفع جريازيف} استخدام roGFP2 خلال التعرض إكسينوبيوتيك يمكن أن يحتمل أن تكشف الكثير عن إليه العمل في عدة نقاط في التتابع الأكسدة وتحول المسارات المرتبطة بها، مثل فوسفات بنتوز (الرقم 1 )³⁵. أجهزة الاستشعار الثاني مناقشتها هنا، فرط، داخل الخلايا ح₂س₂ تحقيقا المستمدة من إدخال البروتين نيون أصفر (يفب) في المجال التنظيمي البكتيرية ح₂س₂-النسخ الحساسة عامل OxyR1³⁶. على الرغم من أن سابقا اعتبر أكسجين تفاعلية مدمرة الوسيطة، ح₂س₂ تحظى باعتراف متزايد كجزيء إشارات داخل الخلايا هامة تحت الظروف الفسيولوجية^{37، 38}، مما يوحي بوجود أدوار غير معروف لح₂س₂ في علم السموم، وكذلك. على سبيل المثال، يمكن أن يكون ح الزائدة₂س₂ الناجمة عن تعرض إكسينوبيوتيك تمهيدا للتقلبات في الإشارات الخلوية أو تحولاً في الاستقلاب.

وأعربت كل من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا في عدة خطوط الخلايا المحددة، بما في ذلك خط الخلية الكبدية شرانيه البشرية A431 وخط الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية بياس-2B، لمراقبة التغييرات في ه_{المدفع جريازيف} وح₂ س₂ في الاستجابة لمجموعة متنوعة من التعرض للسمية. وتشمل هذه الملوثات الغازية (³⁵من الأوزون)، ومكونات قابلة للذوبان من الجسيمات (1، 2 نفتوكينون^39،40 والزنك⁴¹)، والنيكل جسيمات نانوية (بيانات غير منشورة). وتمثل هذه الدراسات فقط مجموعة فرعية صغيرة من التطبيقات الممكنة لهذه اثنين من أجهزة الاستشعار. من الناحية النظرية، يمكن أن تستخدم أي نوع من الخلايا غير قادرة على تلقي والإعراب عن الحمض النووي لأجهزة الاستشعار هذه من خلال تقنيات البيولوجيا الجزيئية التقليدية لتقييم آثار xenobiotics يشتبه في أن يغير حالة الأكسدة الخلوية. وحتى الآن، قد أعربت واحدة أو أكثر من هذه المجسات في مختلف بدائيات النوى وحقيقيات النوى، بما في ذلك عدة الثدييات والنباتات والبكتيريا والخميرة الخلية أنواع^25،26،،من³⁶⁴². قراءات لأجهزة الاستشعار_{2 2}س ه_{المدفع جريازيف} وح تغيير في كثافة fluorescence المنبعثة في 510 نيوتن متر عند الإثارة مع الضوء نانومتر 488 و 404. هذا الأسلوب القدرة على التكيف على نطاق واسع عبر منصات فلوروميتريك، بما في ذلك أنواع مختلفة من الفحص المجهري ([كنفوكل] وواسع المجال) ولوحة من القراء. يسمح الأسلوب الذي قدم إلى هنا للمراقبة حساسة ومحددة من داخل الخلايا ه_{المدفع جريازيف} وح₂س₂ في نظم السمية في المختبر .

Protocol

1-إعداد الخلايا ملاحظة: هذا الإجراء وصف توصيل لينتيفيرال من خط خلية مخلدة (بياس-2 باء؛ ATCC، ماناساس، خامسا) للتعبير عن المراسل المطلوب (roGFP2 أو فرط). يمكن أن تستخدم خطوط/أنواع الخلايا الأخرى و/أو أساليب نقل الجينات، بما في ذلك تعداء، طالما أنها تسفر عن مستوى مراسل التعبير الملائم …

Representative Results

وقد تم استخدام roGFP2 وفرط في الكشف عن التغييرات في هالمدفع جريازيف وداخل الخلايا ح2س2 جيدا الموصوفة سابقا25،36،،من4243 ، ويتضح هنا. [كنفوكل] صور من الخلايا معربا عن roGFP2 في خط الأساس، والإضا?…

Discussion

استخدام roGFP2 وفرط في الكشف عن التغييرات في داخل الخلايا ه_{المدفع جريازيف} وح₂س₂، على التوالي، وقد وصفت جيدا في السابق الدراسات الفسيولوجية وسمية ^{25،35،36 ،،}من^{3940،41،…}

Materials

roGFP2 Plasmid	University of Oregon	N/A	Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid	Evrogen	FP941
Hydrogen Peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	10708984001
9,10-Phenanthrenequinone	Sigma Aldrich	156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes	Ted Pella	14029-20
BEAS-2B cell line	American Type Culture Collection	CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium	Lonza	192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit	Lonza	192060
Excel	Microsoft Office Suite	N/A
NIS-Elements AR Imaging Software	Nikon	N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System	Nikon	N/A