Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren
Summary
Dit manuscript beschrijft het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic verslaggevers in een toepassing voor live-cel imaging voor de behandeling van xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. Deze experimentele aanpak biedt ongeëvenaarde Spatio resolutie, gevoeligheid en specificiteit terwijl het vermijden van veel van de tekortkomingen van conventionele methoden voor de detectie van toxicologische oxidatieve stress.
Abstract
Hoewel oxidatieve stress een vaak geciteerde toxicologische mechanisme is, conventionele methoden te bestuderen, lijden aan een aantal tekortkomingen, met inbegrip van de vernietiging van het monster, invoering van potentiële artefacten, en een gebrek aan specificiteit voor de reactieve betrokken soort. Dus, is er een huidige behoefte op het gebied van toxicologie aan niet-destructieve, gevoelige en specifieke methoden die kunnen worden gebruikt om te observeren en te kwantificeren van intracellulaire redox verstoringen, beter bekend als oxidatieve stress. Hier presenteren we een methode voor het gebruik van twee genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren, roGFP2 en HyPer, om te wonen-cel beeldvormende onderzoeken te observeren xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve reacties worden gebruikt. roGFP2 equilibrates met de glutathion redox potentiële (EGSH), terwijl HyPer direct detecteert waterstof peroxide (H2O2). Beide sensoren kunnen worden uitgedrukt in verschillende celtypen via transfectie of signaaltransductie, en kunnen op specifieke cellulaire compartimenten worden gericht. Bovenal biedt live-cel microscopie met behulp van deze sensoren hoge ruimtelijke en temporele resolutie thats niet mogelijk met behulp van conventionele methoden. Wijzigingen in de intensiteit van de fluorescentie op 510 nm fungeert als de uitlezing voor beide genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren als opeenvolgend opgewonden door 404 bewaakt nm en 488 nm licht. Deze eigenschap maakt beide sensoren ratiometric, elimineren van gemeenschappelijke microscopie artefacten en corrigeren voor verschillen in sensor expressie tussen cellen. Deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid van fluorimetrische platforms geschikt voor spannende en verzamelen emissies bij de voorgeschreven golflengten, waardoor het geschikt is voor gebruik met confocal beeldvormingssystemen, conventionele breed-gebied microscopie en plaat lezers. Beide sensoren genetisch-gecodeerde fluorogenic zijn gebruikt in een verscheidenheid van celtypes en toxicologisch onderzoek cellulaire EGSH en H2O2 generatie in realtime te volgen. Hier geschetst is een gestandaardiseerde methode die is sterk aan te passen op celtypes en fluorimetrische platforms voor de toepassing van roGFP2 en HyPer bij live-cel toxicologische beoordeling van oxidatieve stress.
Introduction
De term “oxidatieve stress” wordt vaak aangehaald als een mechanisme in de toxicologie, maar is zelden deze term specifiek beschreven. Oxidatieve stress kan verwijzen naar verschillende intracellulaire processen, met inbegrip van de generatie van reactieve zuurstof soorten, schade veroorzaakt door vrije radicalen, de oxidatie van antioxidant moleculen, en zelfs de activering van specifieke signalering cascades stroomt. Een breed scala van milieucontaminanten1,2 en farmaceutische agenten3,4 zijn gedocumenteerd te induceren oxidatieve stress door beide directe actie van de xenobiotische compound zelf5 ,6 of subsidiair door productie van oxidant soorten als onderdeel van een cellulaire respons7,8,9,10. Het is daarom van groot belang in de toxicologie nauwkeurig observeren en karakteriseren van de oxidatieve processen die leiden tot negatieve resultaten. Conventionele methodes voor het meten van oxidatieve stress betrekken identificatie van geoxideerde biomoleculen11,12,13,14,15 of antioxidanten16 ,17,18,19,20, of directe meting van reactieve soorten zelf21,22,23, 24. Deze methoden vereisen echter meestal cellulaire ontwrichting, die vaak verbruikt het monster, elimineert ruimtelijke resolutie, en introduceert potentieel artefacten25. De ontwikkeling van meer gevoelige en specifieke methoden voor de detectie van oxidant soorten en markers voor oxidatieve stress geldt in grote lijnen voor het onderzoek van de schadelijke effecten van xenobiotische blootstelling.
Live-cel microscopie met behulp van een nieuwe generatie van genetisch-gecodeerde fluorogenic sensoren heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor de monitoring van de intracellulaire redox-status van levende cellen. Deze sensoren worden meestal uitgedrukt met behulp van een vector onder de controle van een virale promotor die wordt ingevoerd via transfectie of transductie methodologieën. Hoge expressie efficiëntie zijn niet nodig, aangezien de cellen uiten de fluorescerende sensor kunnen gemakkelijk worden visueel geïdentificeerd. Voor de beoordeling van het toxicologische, kunnen cellen uiten deze sensoren worden waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie als ze worden blootgesteld aan xenobiotische verbindingen in real-time. Deze proefopzet toelaat herhaalde metingen in dezelfde cel, waardoor de gevestigde basislijn van elke cel om op te treden als haar eigen controle. De hoge temporele resolutie geboden door live-cel imaging is geschikt voor het opsporen van oxidatieve gebeurtenissen, met name degenen die bescheiden in omvang of aard van voorbijgaande aard zijn. Naast het feit dat zowel de specifieke als de gevoelige naar hun doel-moleculen, kan de fluorescentie van enkele van deze sensoren worden opgewekt met behulp van twee golflengten van licht. Dit verschijnsel kan de fluorescerende uitstoot moet worden uitgedrukt als een ratio die het mogelijk het onderscheidingsvermogen van signaal veranderingen geassocieerd met authentieke sensor reacties van die veroorzaakt door artefacten zoals variaties in cel dikte, expressie van de sensor, lamp maakt intensiteit, photobleaching en gevoeligheid van de detector fluorescentie26. Een ander voordeel van het gebruik van fluorogenic sensoren is dat ze kunnen worden gericht aan specifieke cellulaire compartimenten, een mate van ruimtelijke resolutie die is ongeëvenaard door conventionele methoden25,26,27.
Een grote familie van genetisch-gecodeerde sensoren op basis van groen fluorescent proteïne (GFP) zijn ontwikkeld en gekenmerkt verslag over een breed scala van fysiologische markers, inclusief pH, temperatuur, concentraties van de calcium en de verhouding van de ATP/ADP25 ,28,29,30,31. Opgenomen onder deze zijn de sensoren van de glutathion redox potentiële (EGSH) en waterstof peroxide (H2O2). Terwijl deze sensoren werden ontwikkeld voor toepassingen in redox biologie en fysiologie, zijn ze ook aangepast om te studeren xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. In het bijzonder beschrijft het hier geschetste protocol het gebruik van de roGFP2 van de sensor EGSH en de H2O2 sensor HyPer.
roGFP2 rapporteert over het redoxpotentiaal van intracellulaire verminderde en geoxideerd glutathion (GSH/GSSG) via een redox-Relais met glutathion peroxidase (GPx), glutaredoxin (Grx) en glutathionreductase (GR) (Figuur 1)25, 32 , 33. Glutathion is de overheersende cellulaire antioxidant molecule en vooral in zijn gereduceerde vorm (GSH) in millimolar concentraties in het cytosol25,34aanwezig is. Terwijl EGSH is niet gekoppeld aan een functionele uitkomst, wordt dat herkend als een belangrijke indicator voor de status van de intracellulaire oxidatieve34. Een relatief kleine stijging van de concentratie van GSSG leidt tot een toename in EGSH , die kan worden opgespoord door roGFP2. Even belangrijk, toezicht op EGSH met behulp van roGFP2 tijdens xenobiotische belichtingen kan potentieel onthullen veel over het werkingsmechanisme op verschillende punten in de redox-estafette en bijbehorende studierichtingen, zoals de pentose fosfaat shunt (Figuur 1 )35. De tweede sensor hier besproken, HyPer, is een intracellulair H2O2 sonde afgeleid van het inbrengen van gele fluorescerende eiwit (YFP) in het regelgevend domein van bacteriële H2O2-gevoelige transcriptie factor OxyR136. Hoewel het is eerder beschouwd als een schadelijke reactieve zuurstof tussenliggende, wordt H2O2 steeds meer erkend als een belangrijk intracellulaire signalering molecuul onder fysiologische omstandigheden37, 38, suggereren dat niet-herkende rollen voor H2O2 in de toxicologie ook bestaan. Bijvoorbeeld, zou overtollige H2O2 -geïnduceerd door een xenobiotische blootstelling een voorloper van disregulatie in cellulaire signalering of een verschuiving in de Bioenergetica.
Beide sensoren genetisch-gecodeerde fluorogenic geuit in verschillende bestaande cellijnen, met inbegrip van de menselijke epidermoïde carcinoom cellijn A431 en de menselijke bronchiale epitheliale cellijn BEAS-2B, te observeren veranderingen in EGSH en H2 O2 in reactie op een verscheidenheid van toxicologische risico’s. Het gaat hierbij om verontreinigende gassen (ozon35), oplosbare onderdelen van zwevende deeltjes (1,2 Naftochinon39,40 en zink41) en nikkel nanodeeltjes (niet-gepubliceerde gegevens). Deze studies zijn slechts een klein gedeelte van de mogelijke toepassingen van deze twee sensoren. Theoretisch, kan elk celtype die kan ontvangen en het uiten van het DNA van deze sensoren via conventionele moleculaire biologietechnieken worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van xenobiotica verdacht te veranderen de cellulaire oxidatieve toestand. Tot op heden, heeft een of meer van deze sensoren geuit in diverse prokaryoten en eukaryoten, met inbegrip van verschillende zoogdieren, plant, bacteriële en gist cel typen25,26,36,,42. De uitlezing voor zowel EGSH en H2O2 sensoren is een verandering in de intensiteit van de fluorescentie uitgezonden bij 510 nm na excitatie met 488 en 404 nm licht. Deze methode is zeer aanpasbaar op fluorimetrische platforms, waaronder verschillende soorten van de microscopie (confocale en breed-gebied) en de lezers van de plaat. De methode die hier wordt gepresenteerd zorgt voor gevoelige en specifieke waarneming van intracellulaire EGSH en H2O2 de in vitro toxicologische systemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van roGFP2 en HyPer bij de opsporing van wijzigingen in de intracellulaire EGSH en H2O2, respectievelijk, is goed beschreven in de vorige fysiologische en toxicologische studies 25,35,36 ,39,40,41,42,43. Het pro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Katelyn Lavrich voor hulp bij de proefopzet en manuscript bewerkingen.
Materials
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
References
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
- Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
- Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
- Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
- Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
- Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
- Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
- Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
- Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
- Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P. Gel-based methods in redox proteomics. Biochim Biophys Acta. 1840, 830-837 (2014).
- Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user’s perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
- Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
- Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
- Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
- Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
- Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
- Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
- Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
- Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
- Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
- Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
- Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxid Redox Signal. 13, 621-650 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
- Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
- Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
- Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
- Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
- Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
- Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
- Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
- Cheng, W. -. Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
- Cheng, W. -. Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
- Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
- Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
- Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
- Hou, J. -. T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
- Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
- Cheng, W. -. Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
- Wages, P. A., Cheng, W. -. Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).
