Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren
Summary
Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von genetisch codierte Fluorogenic Reporter in einer live Cell Imaging-Anwendung für die Prüfung der Harnblase-induzierten oxidativen Stress. Diese experimentelle Ansatz bietet unvergleichliche räumlich-zeitliche Auflösung, Sensitivität und Spezifität vieler die Unzulänglichkeiten der konventionellen Methoden zur Erkennung von toxikologischen oxidativen Stress zu vermeiden.
Abstract
Während oxidativer Stress eine häufig zitierte toxikologischen Mechanismus ist, leiden einige Mängel, einschließlich Zerstörung der Probe, Einführung der möglichen Artefakte und mangelnder Spezifität für die reaktive konventionelle Methoden zu studieren beteiligten Spezies. So gibt es einen aktuellen Bedarf auf dem Gebiet der Toxikologie für die zerstörungsfreie, sensitive und spezifische Methoden, die verwendet werden können, zu beobachten und zu quantifizieren, intrazellulären Redox-Störungen, häufiger als oxidativer Stress bezeichnet. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die Verwendung von zwei genetisch codierte Fluorogenic Sensoren, roGFP2 und HyPer in live Cell imaging Studien verwendet werden, um Fremdstoff-induzierte oxidative Reaktionen zu beobachten. roGFP2 gestalten mit der Glutathion-Redoxpotential (EGSH), während HyPer direkt erkennt Wasserstoffperoxid (H2O2). Beide Sensoren in verschiedenen Zelltypen über Transfektion oder Transduktion ausgedrückt werden können, und können zu bestimmten zellulären Kompartimenten ausgerichtet sein. Am wichtigsten ist, bietet live-Cell-Mikroskopie mit diesen Sensoren hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung, der mit herkömmlichen Methoden nicht möglich ist. Änderungen in der Fluoreszenzintensität überwacht bei 510 nm dient als Anzeige für beide genetisch codierte Fluorogenic Sensoren nacheinander begeistert von 404 nm und 488 nm Licht. Diese Eigenschaft macht beide Sensoren ratiometrischen, Beseitigung von gemeinsamen Mikroskopie Artefakte und Berichtigung für Unterschiede bei den Sensor Ausdruck zwischen den Zellen. Diese Methodik kann über eine Vielzahl von fluorometrisch Plattformen in der Lage, spannende und sammeln von Emissionen bei der vorgeschriebenen Wellenlängen, bildet es verwendbar für Gebrauch mit konfokale bildgebenden Systemen, konventionellen Weitfeld-Mikroskopie und Platte Leserinnen und Leser. Beide Fluorogenic genetisch codierten Sensoren wurden in einer Vielzahl von Zelltypen und toxikologischen Studien zur zellulären EGSH und H2O2 Generation in Echtzeit zu überwachen. Die hier skizzierten ist eine standardisierte Methode, die allgemein anpassungsfähig Zelltypen und fluorometrisch plattformübergreifend für die Anwendung von roGFP2 und HyPer im Leben-Zelle toxikologische Bewertungen von oxidativem Stress.
Introduction
Der Begriff “oxidativer Stress” häufig als einen Mechanismus in der Toxikologie, zitiert ist noch ist selten dieser Begriff konkret beschrieben. Oxidativer Stress kann beziehen sich auf verschiedene intrazelluläre Prozesse, einschließlich der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies, Schäden durch freie Radikale, die Oxidation von antioxidativen Molekülen, und auch die Aktivierung der spezifischen Signalisierung Kaskaden. Ein breites Spektrum von Umweltkontaminanten1,2 und pharmazeutische Wirkstoffe3,4 , oxidativen Stress durch entweder direkte Aktion der Xenobiotika Verbindung selbst5 induzieren dokumentiert wurden ,6 oder sekundär durch Produktion von Oxidationsmittel Arten im Rahmen einer zellulären Antwort7,8,9,10. Es ist daher von großem Interesse in der Toxikologie genau zu beobachten und charakterisieren die oxidative Prozesse, die zu unerwünschten Ergebnissen führen. Herkömmliche Methoden der Messung von oxidativen Stress beteiligt Identifizierung von oxidierter Biomoleküle11,12,13,14,15 oder Antioxidantien16 ,17,18,19,20, oder die direkte Messung von reaktiven Spezies sich21,22,23, 24. Diese Methoden erfordern jedoch in der Regel zellulären Störungen, die oft verbraucht die Probe, beseitigt räumlichen Auflösung und potenziell stellt Artefakte25. Die Entwicklung sensitiver und spezifischer Methoden für die Erkennung von Oxidationsmittel Arten und Marker des oxidativen Stresses ist breit anwendbar für die Untersuchung der Nebenwirkungen von Xenobiotika Exposition.
Live-Cell-Mikroskopie mit einer neuen Generation von genetisch codierte Fluorogenic Sensoren ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Überwachung des intrazellulären Redox-Status von lebenden Zellen entstanden. Diese Sensoren sind in der Regel durch einen Vektor unter der Kontrolle von viralen Promotor, der über Transfektion oder Transduktion Methoden eingeführt wird ausgedrückt. Hohe Expression Wirkungsgrade sind nicht notwendig, da Zellen, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Sensors optisch leicht identifiziert werden können. Für die toxikologische Beurteilung können Zellen, die mit dem Ausdruck dieser Sensoren mit Fluoreszenz-Mikroskopie, wie sie, insbesondere Verbindungen in Echtzeit ausgesetzt sind beobachtet werden. Diese Versuchsanordnung erlaubt wiederholte Messungen in der gleichen Zelle, so dass jede Zelle etablierten Grundlinie als seine eigene Kontrolle zu handeln. Die hohe zeitliche Auflösung, die gebotene live Cell Imaging eignet sich gut für die Erkennung von oxidativen Ereignisse, insbesondere solche, die bescheiden in Größe oder Transienten in der Natur sind. Abgesehen davon, dass Sensitivität und Spezifität zu ihren Zielmolekülen, kann die Fluoreszenz von einigen dieser Sensoren mit zwei Wellenlängen des Lichts angeregt werden. Dieses Phänomen ermöglicht die fluoreszente Emission als Verhältnis, ausgedrückt werden, das ermöglicht die Unterscheidung der Signal Veränderungen im Zusammenhang mit authentischen Sensor Antworten von denen verursacht durch Artefakte wie Variationen im Sensor Ausdruck, Zelle Dicke, Lampe Intensität, Immunofluoreszenz und Empfindlichkeit der Fluoreszenz-Detektor-26. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Fluorogenic Sensoren ist, dass sie können, um spezifische zelluläre Fächer ausgerichtet werden, erstellen ein Maß an räumlicher Auflösung, der durch konventionelle Methoden25,26,27unübertroffen ist.
Eine große Familie von genetisch codierten Sensoren basierend auf grün fluoreszierendes Protein (GFP) entwickelt und charakterisiert, Bericht über eine Vielzahl von physiologischer Marker, einschließlich pH-Wert, Temperatur, Kalzium-Konzentrationen und das ATP/ADP-Verhältnis25 ,28,29,30,31. Unter diesen sind Sensoren des Glutathion Redoxpotential (EGSH) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Während diese Sensoren für Anwendungen in der Redox-Biologie und Physiologie entwickelt wurden, wurden sie auch angepasst, Fremdstoff-induzierten oxidativen Stress zu studieren. Insbesondere beschreibt das Protokoll hier skizzierten die Nutzung von E-GSH -Sensor roGFP2 und H2O2 Sensor HyPer.
roGFP2 berichtet über das Redoxpotential von intrazellulären reduzierte und oxidierte Glutathion (GSH/GSSG) über ein Redox-Relais mit Glutathion-Peroxidase (GPx), Glutaredoxin (Grx) und Glutathion-Reduktase (GR) (Abbildung 1)25, 32 , 33. Glutathion ist das vorherrschende zelluläre antioxidative Molekül und ist in erster Linie in seiner reduzierten Form (GSH) in millimolaren Konzentrationen im Zytosol25,34. Während EGSH nicht mit irgendeinem funktionellen Ergebnis verbunden worden ist, wird es als ein wichtiger Indikator der intrazellulären oxidativen Status34erkannt. Eine relativ geringe Erhöhung der Konzentration von GSSG führt zu einer Erhöhung in EGSH , die durch roGFP2 nachweisbar ist. Ebenso wichtig, Überwachung der EGSH mit roGFP2 bei Xenobiotika Belichtungszeiten kann potenziell verraten viel über den Wirkmechanismus an mehreren Stellen in der Redox-Staffel und damit verbundenen Wege, wie die Pentose-Phosphat-shunt (Abbildung 1 )35. Der zweite Sensor hier diskutiert, HyPer, ist eine intrazelluläre H2O2 Sonde abgeleitet aus der Einfügung gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) in der regulatorischen Domäne von bakteriellen H2O2-sensible Transkription Faktor OxyR136. Obwohl es zuvor eine schädliche reaktiven Sauerstoff Mittelstufe behandelt hat, ist H2O2 zunehmend als eine wichtige intrazelluläre Signalmolekül unter physiologischen Bedingungen37, erkannt 38, was darauf hindeutet, dass unbekannte Rollen für H2O2 in der Toxikologie als auch vorhanden sind. Zum Beispiel könnte überschüssige H2O2 induziert durch Xenobiotika Exposition eine Vorstufe zu Dysregulation in zellulären Signal- oder eine Verschiebung der Bioenergetik.
Beide Fluorogenic genetisch codierten Sensoren wurden in mehrere etablierte Zelllinien, einschließlich der menschlichen epidermoid Carcinoma Zelle A431 und menschlichen bronchialen Epithelzelle Linie BEAS-2 b, zu Änderungen in EGSH und H2 beobachten geäußert O2 in Reaktion auf eine Vielzahl von toxikologischen Belichtungen. Dazu gehören gasförmige Schadstoffe (Ozon-35), lösliche Bestandteile von Feinstaub (1,2 Naphthoquinone39,40 und Zink41) und Nickel-Nanopartikel (unveröffentlichte Daten). Diese Studien stellen nur eine kleine Teilmenge der möglichen Anwendungen der beiden Sensoren. Theoretisch kann jeden Zelltyp, der empfangen und mit dem Ausdruck der DNS dieser Sensoren durch konventionelle molekularbiologische Techniken kann, genutzt werden, um die Beurteilung der Auswirkungen von Xenobiotika im Verdacht, den zellulären oxidativen Status ändern. Bis heute hat eine oder mehrere dieser Sensoren in verschiedenen Prokaryoten und Eukaryoten, darunter mehrere Säugetier, Pflanze, Bakterien und Hefe Zelle Arten25,26,36,42geäußert. Die Anzeige für EGSH und H2O2 Sensoren ist eine Änderung in der Intensität der Fluoreszenz emittiert bei 510 nm bei Anregung mit 488 und 404 nm-Licht. Diese Methode ist allgemein anpassungsfähig auf fluorometrisch Plattformen, einschließlich verschiedene Arten von Mikroskopie (konfokale und Weitfeld-) und Platte Leser. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht empfindliche und spezifische Beobachtung der intrazellulären EGSH und H2O2 de in-vitro- toxikologischen Systeme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von roGFP2 und HyPer bei der Erkennung von Änderungen im intrazellulären EGSH und H2O2, bzw. wurde gut beschrieben in früheren physiologische und toxikologische Studien 25,35,36 ,39,40,41,42,43. Das Protok…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Katelyn Lavrich danken für Unterstützung bei der Versuchsplanung und Manuskript bearbeitet.
Materials
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
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