הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

Summary

כתב יד זה מתאר את השימוש fluorogenic מקודד גנטית כתבים ביישום של הדמיה לחיות תאים עבור הבחינה של xenobiotic-induced סטרס חמצוני. זו גישה נסיונית מציע רזולוציית ייתכן ללא תחרות, רגישות וספציפיות תוך הימנעות רבים את חסרונותיה של שיטות קונבנציונליות המשמש את הגילוי של רעילות סטרס חמצוני.

Abstract

בזמן סטרס חמצוני הוא מנגנון רעילות מצוטט לעתים קרובות, שיטות קונבנציונליות ללמוד אותו סובלים מספר חסרונות, כולל הרס של המדגם, החדרת חפצים פוטנציאל חוסר ירידה לפרטים עבור תגובתי מינים מעורבים. לפיכך, יש צורך הנוכחי בשדה של הרעלים עבור שיטות הרסניות, רגיש, ספציפי יכול לשמש כדי להתבונן ולכמת לפליטת תאיים חמצון-חיזור, יותר נפוץ המכונה סטרס חמצוני. כאן, אנו מציגים שיטה לשימוש של שני חיישנים מקודד גנטית fluorogenic, roGFP2 ו- HyPer, כדי לשמש מחקרי הדמיה לחיות תאים להתבונן בהשפעה xenobiotic תגובות חמצון. roGFP2 equilibrates עם גלוטתיון חמצון-חיזור פוטנציאליים (E_GSH), בעוד HyPer ישירות מאתר חמצן (H₂O₂). שני חיישנים יכול להתבטא לתוך סוגי תאים שונים באמצעות תרביות תאים או התמרה חושית, ניתן לפלח כך תאים סלולריים ספציפיים. והכי חשוב, מיקרוסקופיה לחיות תאים באמצעות חיישנים אלה מציע יכולות ברזולוציה גבוהה אינה אפשרית בשיטות הקונבנציונלית. שינויים בעוצמת פלורסצנטיות למצלמות 510 ננומטר משמש בתור המדידה עבור שני חיישנים fluorogenic מקודד גנטית כשהוא מתרגש ברצף על ידי 404 nm ואור 488 ננומטר. מאפיין זה עושה רציומטרי שני חיישנים, סילוק חפצים מיקרוסקופ נפוצות ובתיקון הבדלים בביטוי חיישן בין תאים. מתודולוגיה זו יכול להיות מיושם במגוון פלטפורמות fluorometric מסוגל פליטת איסוף ומרגש באורכי גל מרשם, שהופך אותו מתאים לשימוש עם מערכות הדמיה קונאפוקלית מיקרוסקופ רחב-שדות קונבנציונלי, צלחת הקוראים. שני חיישנים fluorogenic מקודד גנטית שימשו במגוון של סוגי תאים ומחקרים על רעילות המוצר לפיקוח אלקטרוני הסלולר_GSH ו- H₂O₂ הדור בזמן אמת. שמפורטות כאן היא שיטה סטנדרטית שניתן לסגלה באופן נרחב על פני סוגי תאים ופלטפורמות fluorometric עבור היישום של roGFP2 ושל HyPer לחיות תאים הערכות רעילות של סטרס חמצוני.

Introduction

המונח “עקה” מצוטט לעתים קרובות כמנגנון של רעלים, עדיין רחוקות הוא מונח זה תיאר באופן ספציפי. סטרס חמצוני ניתן להפנות למספר תהליכים תאיים, כולל דור של מינים חמצן תגובתי, הנזק שנגרם על ידי רדיקלים חופשיים, החמצון של מולקולות נוגדות חמצון, וגולש אפילו את הפעלת איתות ספציפיים. מגוון רחב של מזהמים סביבתיים^1,2 ו-^3,סוכנים התרופות⁴ תועדו לזירוז סטרס חמצוני על ידי פעולה ישירה או של המתחם xenobiotic עצמה^{5 ,6} או שנית על-ידי ייצור של חמצון מינים כחלק תגובת תאי^7,8,9,10. לכן זה עניין רב ב באימון במדויק לבחון ולאפיין את תהליכי החמצון שמוביל תוצאות שליליות. שיטות קונבנציונליות של מדידת לחץ חימצוני לערב זיהוי של מולקולות מחמצנים^{11,12,13,14,15} או נוגדי חמצון^{16 ,17,18,19,20}, או מדידה ישירה של מינים תגובתי עצמם^{21,22,23, 24}. עם זאת, שיטות אלה מצריכים בדרך כלל הפרעה הסלולר, אשר לעתים קרובות צורכת את הדגימה מבטלת רזולוציה מרחבית, פוטנציאל מציג ממצאים²⁵. בפיתוח שיטות יותר רגיש וספציפי של זיהוי המינים חמצון, סמנים של סטרס חמצוני ישימה בהרחבה על החקירה של ההשפעות השליליות של החשיפה xenobiotic.

מיקרוסקופ לחיות תאים באמצעות דור חדש של חיישנים fluorogenic מקודד גנטית התפתחה כלי רב עוצמה כדי לפקח על מצב חמצון-חיזור תאיים של תאים חיים. חיישנים אלה מתבטאים בדרך כלל באמצעות וקטור תחת השליטה של יזם ויראלי הוא הציג באמצעות מתודולוגיות תרביות תאים או התמרה חושית. ביטוי גבוה יעילות אינם הכרחיים, מאז התאים לבטא את החיישן פלורסנט ניתן לזהות בקלות באופן חזותי. עבור הערכות רעילות, התאים לבטא חיישנים אלה יכול להיות שנצפו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות כפי שהם נחשפים תרכובות xenobiotic בזמן אמת. עיצוב ניסיוני זה מאפשר מדידות חוזרות באותו התא, המאפשר הבסיסית לכל תא הוקמה לשמש את שליטתה. ברזולוציה הטמפורלית גבוהה המוענקת על ידי הדמיה לחיות תאים הוא מתאים היטב עבור זיהוי אירועים חמצוני, במיוחד אלה צנוע בסולם ריכטר או ארעי בטבע. בנוסף גם רגישה וגם ספציפית כדי מולקולות היעד שלהם, ידי קרינה פלואורסצנטית של כמה חיישנים אלה יכולים להיות שמחים באמצעות שני אורכי הגל של האור. תופעה זו מאפשרת הפליטה לבטא יחס, דבר המאפשר הבחנה של האות שינויים הקשורים עם חיישן אותנטי תגובות מאלה שנגרמו על ידי חפצים כגון וריאציות חיישן ביטוי, עובי התא, מנורת פלורסנט העוצמה, photobleaching, ורגישות של גלאי קרינה פלואורסצנטית²⁶. יתרון נוסף של השימוש של חיישנים fluorogenic הוא כי הם ניתן לפלח כך ספציפי מדורים הסלולר, יצירת רמת רזולוציה מרחבית ללא תחרות על ידי שיטות קונבנציונליות^25,26,27.

יש לי משפחה גדולה של חיישנים מקודד גנטית בהתבסס על חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) פותחה, מאופיין לדווח על מגוון רחב של סמנים פיזיולוגיים, כולל ה-pH, טמפרטורה, ריכוזי סידן, היחס ATP/ADP^{25 ,28,29,30,31}. בין אלה נכללים חיישנים של גלוטתיון חמצון-חיזור פוטנציאליים (E_GSH), מימן על-חמצני (H₂O₂) על כל שטח התקליטור. בעוד חיישנים אלה פותחו עבור יישומים חמצון-חיזור ופיזיולוגיה, הם גם הותאמו ללמוד xenobiotic-induced סטרס חמצוני. באופן ספציפי, פרוטוקול שמפורטות כאן מתאר את השימוש roGFP2 חיישן אלקטרוני_GSH את החיישן_{2 2}O H HyPer.

roGFP2 מדווח על הפוטנציאל חמצון-חיזור תאיים מופחתת ו מחמצנים גלוטתיון (GSH/GSSG) דרך העברת חמצון-חיזור מעורבים peroxidase גלוטתיון (GPx), glutaredoxin (Grx) ו גלוטתיון רדוקטאז (גר) (איור 1)^{25, 32 , 33}. גלוטתיון הוא המולקולה השולט הסלולר נוגד חמצון, והוא נוכח בעיקר בצורתו מופחתת (GSH) בריכוזים millimolar ב-^25,ציטוזול³⁴. בעוד E_GSH לא נקשר לכל תוצאה פונקציונלית, הוא מוכר בתור מדד חשוב של מצב חמצוני תאיים³⁴. גידול קטן יחסית של הריכוז של GSSG גורמת עלייה E_GSH זה לזיהוי על-ידי roGFP2. לא פחות חשוב, ניטור של E_GSH השימוש roGFP2 במהלך חשיפות xenobiotic יכול באופן פוטנציאלי לגלות הרבה על מנגנון הפעולה במספר נקודות הממסר חמצון-חיזור ולעודד מסלולים הקשורים, כגון פוספט פנטוז (איור 1 )³⁵. החיישן השני שנדונו כאן, HyPer, הוא בדיקה תאיים של_{2 2}O H נגזר מן הכניסה של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) לתוך תחום הרגולציה של חיידקי H₂O₂-תמלול רגיש פקטור OxyR1³⁶. למרות זאת בעבר נחשב של חמצן תגובתי מזיק ביניים, H₂O₂ הוא יותר ויותר להכרה של מולקולת איתות תאיים חשובים תחת התנאים הפיזיולוגיים^{37, 38}, רומז כי תפקידים לא מזוהה עבור H₂O₂ קיימים רעלים גם כן. למשל, עודף H₂O₂ הנגרם על ידי חשיפה xenobiotic יכול להיות הקדמה dysregulation באיתות או שינוי מצב ביואנרגיה.

שני חיישנים fluorogenic מקודד גנטית הביעו במספר שורות תאים הוקמה, כולל את האנושי קרצינומה epidermoid תא A431 ובין תאי אפיתל הסמפונות אדם הקו BEAS-2B, לצפות לשינויים E_GSH ו- H₂ O₂ בתגובה מגוון של חשיפות רעילות. אלה כוללים מזהמים גזי (אוזון³⁵), מרכיבים מסיסים של חלקיקי החומר (1, 2 naphthoquinone^39,40 ואבץ⁴¹), ניקל חלקיקים (נתונים שלא פורסמו). מחקרים אלה מייצגים רק קבוצת משנה קטנה של היישומים האפשריים של חיישנים שני אלה. תיאורטית, כל סוג התא מסוגל קבלת ולבטא את ה-DNA של חיישנים אלה באמצעות שיטות בביולוגיה מולקולרית קונבנציונלי יכול להיות מנוצל כדי להעריך את ההשפעות של ואינטראקציות חשד לשנות המדינה חמצוני הסלולר. נכון להיום, אחד או יותר של חיישנים אלה נתגלתה ובמיקומים שונים אאוקריוטים פרוקריוטים, כולל מספר מידע יונקים, צמח, בקטריאלית של שמרים תא סוגי^25,26,36,42. המדידה עבור חיישנים_{2 2}O E_GSH ו- H הוא שינוי בעוצמת פלורסצנטיות הנפלטים-510 ננומטר על עירור עם 488, 404 אור ננומטר. שיטה זו היא יכולת הסתגלות נרחב הפלטפורמות fluorometric, כולל סוגים שונים של מיקרוסקופ (קונאפוקלית, שדה רחב), קוראי צלחת. השיטה המוצגת כאן מאפשר תצפית רגיש וספציפי של E_GSH ו- H תאיים₂O₂ במערכות במבחנה רעילות.

Protocol

1. הכנת תאים הערה: הליך זה מתאר את התמרה חושית lentiviral של קו תא מונצחים (BEAS-2B; בקרת האוויר, במנאסס, VA) כדי להביע את הכתב הרצויה (roGFP2 או HyPer). יכול להיות מנוצל קווים/סוגי תאים אחרים ו/או שיטות של העברה גנטית, כולל תרביות תאים, כל עוד הם תוצאה של רמה של הכתב ביטוי הולם לדמיין מספר מספיק של…

Representative Results

השימוש roGFP2 HyPer באיתור שינויים EGSH ו- H תאיים2O2 היה טוב כפי שתוארה לעיל25,36,42,43 , הוא שמוצג כאן. תמונות קונאפוקלית של תאים לבטא roGFP2 בסיסית, הבאים תוספת של2O H2 ו- DTT מוצגים <strong class="xf…

Discussion

השימוש roGFP2 HyPer באיתור שינויים תאיים E_GSH ו- H₂O₂, בהתאמה, כבר היטב תיאר הקודם מחקרים פיזיולוגיים רעילות ^{25,35,36 ,39,40,41,42,43}. פרוטוקול ?…

Materials

roGFP2 Plasmid	University of Oregon	N/A	Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid	Evrogen	FP941
Hydrogen Peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	10708984001
9,10-Phenanthrenequinone	Sigma Aldrich	156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes	Ted Pella	14029-20
BEAS-2B cell line	American Type Culture Collection	CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium	Lonza	192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit	Lonza	192060
Excel	Microsoft Office Suite	N/A
NIS-Elements AR Imaging Software	Nikon	N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System	Nikon	N/A