遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング
Summary
本稿では、異物による酸化ストレスの検討のため住セルイメージ投射の遺伝子にコードされた蛍光レポーターの使用について説明します。この実験的アプローチでは、毒性学的酸化ストレス検査に用いられる従来の欠点の多くを回避しながら比類のない時空間分解能、感度、特異性を提供しています。
Abstract
酸化ストレスは一般に引用された毒性学的メカニズムが、それを研究する従来の方法に苦しむサンプル、潜在的なアイテムの紹介と、反応の特異性の欠如の破壊を含む、欠点の数関与する種。従って、非破壊、敏感なと具体的な方法を観察しより一般的に呼ばれる酸化ストレス、細胞内レドックスの摂動を定量化するための毒物学の分野で現在の必要性があります。RoGFP2 とハイパー、異物による酸化的応答を観察する生細胞イメージング研究で使用する 2 つの遺伝子にコードされた蛍光センサーの使用法を紹介します。roGFP2 は、ハイパー中グルタチオン酸化還元電位 (EGSH) である過酸化水素 (H2O2) を直接検出します。両方のセンサーは、トランスフェクションや伝達、経由でさまざまな種類の細胞に表現できるので、特定の細胞コンパートメントをターゲットすることができます。最も重要なは、これらのセンサーを用いた生細胞顕微鏡は、従来の方法を使用して可能ではない高の空間的で、一時的な解像度を提供しています。510 nm で順番に 404 によって励起され、両方の遺伝子にコードされた蛍光センサーの読み出しとして監視の蛍光強度の変化 nm、488 nm の光。このプロパティは、共通の顕微鏡によるアーチファクトの除去とセンサー式のセルの間の違いを補正する両方のセンサーのレシオ メトリックです。さまざまな共焦点イメージング システム、従来の広視野顕微鏡、プレートでの使用に適しており、所定の波長でエキサイティングで収集排出できる蛍光プラットフォームこの方法論を適用できます。読者。両方の遺伝子にコードされた蛍光センサーは、携帯電話の EGSHと H2O2世代リアルタイムで監視するさまざまなセルタイプおよび毒性学的研究で使用されています。ここで説明は、細胞の種類や酸化ストレスの細胞毒性評価に roGFP2 とハイパー用蛍光プラットフォーム間で広く適応可能である標準化された方法です。
Introduction
用語「酸化ストレス」は毒性のメカニズムとして頻繁に引用されまだ稀、この用語です具体的に説明されています。酸化ストレスは活性酸素、フリーラジカル、抗酸化剤分子の酸化によって引き起こされる損傷の生成を含むいくつかの細胞内プロセスを参照でき、特定のシグナリングの活性化もカスケードします。5 異物化合物自体のいずれかの直接作用によって酸化ストレスを誘導する広範な環境汚染物質1,2と医薬品3,4に記載されています。、6または細胞応答7,8,9,10の一部として酸化種の生産によって第二。だからこそ、それを正確に観察し、副作用につながる酸化プロセスを特徴付ける毒物学に大きな関心の。酸化ストレス測定の従来の方法を含む酸化生体11,12,13,14,15または 16の抗酸化物質の同定 ,17,18,19、20、または21,22,23、自体反応種の直接測定 24。ただし、これらのメソッドは、通常細胞の中断は、しばしばサンプルを消費、空間分解能を排除し、可能性のある成果物25を紹介を必要です。酸化種の検出および酸化ストレスのマーカーのより敏感な特定の方法の開発、生体異物露出の副作用の調査に広く適用。
遺伝子にコードされた蛍光センサーの新世代を用いた生細胞顕微鏡は、生きた細胞の細胞内酸化還元状態を監視する強力なツールとして浮上しています。これらのセンサーは、通常、トランスフェクションや伝達の方法論によって導入されたウイルス プロモーターの制御の下でベクトルを使用して表されます。蛍光センサーを発現する細胞は視覚的に簡単に識別することができますので、高発現効率は、必要ありません。毒性学的評価は、蛍光顕微鏡を使用してリアルタイムで異物化合物に公開されているこれらのセンサーを発現する細胞を観察できます。この実験的なデザインは、独自のコントロールとして動作する各セルの確立されたベースラインを許可する同じセルで繰り返し測定を許可します。住セルイメージ投射によって与えられる高時間分解能は控えめな大きさか一時的な自然の中で、特に酸化のイベントの検出に適してします。ターゲット分子に敏感な特定であること、に加えて 2 つの波長の光を使用してこれらのセンサーのいくつかの蛍光を励起することができます。この現象により、センサー式、セル厚、ランプの変化など工芸品によって引き起こされたものから本格的なセンサーの応答に関連付けられている信号変化の識別を可能にする比率として表現される蛍光発光強度や退色、蛍光検出器26の感度。蛍光センサーの使用のもう一つの利点は、その対象とは従来25,26,27によって比類のない空間分解能のレベルを作成する特定の細胞コンパートメントです。
緑色蛍光タンパク質 (GFP) 遺伝子にコードされたセンサーの大家族が開発されさまざまな生理学的マーカーは、pH、温度、カルシウム濃度、ATP/ADP 比25 などのレポートに特徴づけられる ,28,29,30,31。これらの中で含まれているグルタチオン酸化還元電位 (EGSH) と過酸化水素 (H2O2) のセンサーです。一方、これらのセンサーは、酸化還元の生物学および生理学のアプリケーション用に開発された、彼らはまた異物による酸化ストレス研究に適応されています。具体的には、ここで説明したプロトコルでは、EGSHセンサー roGFP2 と H2O2センサー ハイパーの使用について説明します。
roGFP2 細胞内還元と酸化型グルタチオン (GSH/GSSG) グルタチオンペルオキシダーゼ (GPx)、glutaredoxin (Grx) やグルタチオン還元酵素を含む酸化還元リレー経由の酸化還元電位 (GR) (図 1)25,報告します。32,33. グルタチオンは、優勢な細胞の抗酸化分子が細胞質25,34中 millimolar 濃度の形 (GSH) で主に存在します。EGSHはない任意の機能的な結果にリンクされている、しながら、細胞内の酸化状態の34の重要な指標として認識されます。GSSG の濃度の比較的小さい増加は roGFP2 によって検出不可能である Eグルタチオン (gsh)の増加の結果します。同様に Eグルタチオン (gsh)の監視、重要な異物のエクスポー ジャーの中に roGFP2 を使用することができます潜在的明らかに酸化還元リレーでいくつかのポイントでのアクションのメカニズムについてはあまりしペントース リン酸などの関連付けられている経路シャント (図 1)35。ここで説明した 2 番目のセンサー、ハイパーに由来する細菌の H2O2の規制領域に黄色い蛍光蛋白質 (YFP) を挿入の細胞内 H2O2プローブ-敏感な転写係数 OxyR136。H2O2はますます生理的条件37,重要な細胞内シグナル伝達分子として認識されているが、以前考えられていた有害な活性酸素中間、38, 毒物学同様に H2O2の認識できない役割が存在することを示唆します。例えば、異物曝露による過剰な H2O2は、細胞内シグナル伝達や、生体エネルギーのシフトで破綻の前兆かもしれない。
両方の遺伝子にコードされた蛍光センサーはひと類表皮癌細胞株 A431 ひと気管支上皮細胞線ベアス-2 b、EGSHと H2 の変化を観察するなど、いくつかの確立されたセルラインで表現されています。O2さまざまな毒性のエクスポー ジャーに対応。ガス状汚染物質 (オゾン35)、粒子状物質 (1, 2 ナフトキノン39,40 , 亜鉛41)、およびニッケル微粒子 (未発表データ) の水溶性成分が含まれます。これらの研究は、これらの 2 つのセンサーの応用の可能性の小さなサブセットのみを表します。理論的には、受信し、従来の分子生物学的手法によってこれらのセンサーの DNA を表現することができる任意のセル型は、細胞の酸化状態を変更する疑いのある化学物質の効果を評価するために利用できます。日には、1 つ以上これらのセンサーは、様々 な原核生物と真核生物、いくつかの哺乳類、植物、細菌、および酵母細胞の種類25,26,36,42を含むで表現されています。EGSHと H2O2センサーの読み出しは 510 で放出される蛍光強度の変化 488 と 404 nm の光を励起に nm。このメソッドは、各種顕微鏡 (共焦点と広視野)、プレート リーダーを含め、蛍光のプラットフォームに広く適応されます。ここで紹介した方法は O2 体外毒性学的システムにおける細胞内GSH E と H2の特異的かつ高感度の観測できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
それぞれ、細胞内GSH E と H2O2の変更の検出で roGFP2 とハイパーの使用は25,生理学的及び毒性学的研究前35,36 によく記載されています。 ,,3940,41,42,43。ここで説明したプロ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、実験的なデザインと原稿編集支援のケイトリン Lavrich を感謝したいです。
Materials
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
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