Imaging tilnærminger til vurderinger av toksikologiske oksidativt Stress bruker genetisk kodet Fluorogenic sensorer

Summary

Dette manuskriptet beskriver bruk av genetisk kodet fluorogenic journalister i et program for live-celle imaging for undersøkelse av xenobiotic oval-indusert oksidativt stress. Denne eksperimentelle tilbyr enestående spatiotemporal oppløsning, sensitivitet og spesifisitet og unngå mange av svakhetene ved konvensjonelle metoder brukt for påvisning av toksikologiske oksidativt stress.

Abstract

Mens oksidativt stress er en ofte siterte toksikologiske mekanisme, lider konvensjonelle metoder til å studere den av en rekke svakheter, inkludert ødeleggelse av prøven, innføring av potensielle gjenstander og mangel på spesifisitet for den reaktive arter involvert. Dermed er det gjeldende behov innen toksikologi for ikke-destruktiv, følsom og bestemte metoder som kan brukes til å observere og kvantifisere intracellulær redoks forstyrrelser, oftere referert til som oksidativt stress. Her presenterer vi en metode for bruk av to genetisk kodet fluorogenic sensorer, roGFP2 og HyPer, skal brukes i live-celle tenkelig studier for å observere xenobiotic oval-indusert oksidativt svar. roGFP2 equilibrates med av glutation redoks potensielle (E_GSH), mens HyPer direkte oppdager hydrogenperoksid (H₂O₂). Begge sensorer kan uttrykkes i ulike celletyper via transfection eller signaltransduksjon og kan rettes mot bestemte mobilnettet avdelinger. Viktigst, tilbyr live-celle mikroskopi basert på disse følerne høy romlig og tidsmessige oppløsning som ikke er mulig å bruke konvensjonelle metoder. Endringer i fluorescens intensiteten overvåket på 510 nm serverer som er avlesning for begge genetisk kodet fluorogenic sensorer når sekvensielt opphisset av 404 nm og 488 nm lys. Denne egenskapen gjør begge sensorer ratiometric, eliminere vanlige mikroskopi gjenstander og korrigerer for forskjeller i sensor uttrykk mellom celler. Denne metoden kan brukes på en rekke fluorometric plattformer kan spennende og samle utslipp foreskrevet bølgelengdene, godt egnet for bruk med AC confocal imaging-systemer, konvensjonelle wide-field mikroskopi og plate lesere. Begge genetisk kodet fluorogenic sensorer har blitt brukt i en rekke celletyper og toksikologiske studier overvåke mobilnettet E_GSH og H₂O₂ generasjon i sanntid. Skissert her er en standardisert metode som mye tilpasses over celletyper og fluorometric plattformer for anvendelse av roGFP2 og HyPer i live-celle toksikologiske vurderinger av oksidativt stress.

Introduction

Begrepet “oksidativt stress” er ofte sitert som en mekanisme i toksikologi, men er sjelden dette begrepet beskrives spesifikt. Oksidativt stress kan referere til flere intracellulær prosesser, inkludert generering av reaktive oksygen arter, skader forårsaket av frie radikaler, oksidasjon av antioksidant molekyler, og selv aktivering av spesifikke signalering kaskader. Et bredt spekter av miljøgifter^1,2 og farmasøytisk agenter^3,4 er dokumentert for å indusere oksidativt stress av enten direkte aksjon av den xenobiotic oval sammensatt seg^{5 ,6} eller sekundært ved produksjon av oksiderende arter som del av en cellulær respons^7,8,9,10. Derfor er av stor interesse i toksikologi nøyaktig observere og karakterisere oksidativt prosessene fører til uønskede resultater. Konvensjonelle metoder for måling oksidativt stress involverer identifisering av oksidert biomolecules,^11,,^12,,^13,,^14,,¹⁵ eller antioksidanter^{16 ,17,18,19,20}eller direkte måling av reaktive arter seg^{21,22,23, 24}. Disse metodene krever imidlertid vanligvis mobilnettet avbrudd, som ofte bruker eksemplet fjerner romlig oppløsning og potensielt introduserer gjenstander²⁵. Utvikling av mer følsom og spesifikke metoder for påvisning av oksiderende arter og markører for oksidativt stress er bredt aktuelt å undersøke bivirkninger av xenobiotic oval eksponering.

Live-celle mikroskopi ved hjelp av en ny generasjon av genetisk kodet fluorogenic sensorer har dukket opp som et kraftig verktøy for å overvåke statusen intracellulær redoks for levende celler. Disse sensorene angis vanligvis ved hjelp av en vektor under kontroll av en viral selskapet som føres via transfection eller signaltransduksjon metoder. Høy uttrykk effektivitet er ikke nødvendig siden celler uttrykke fluorescerende sensoren kan lett identifiseres visuelt. For toksikologiske vurderinger, kan celler som uttrykker disse sensorene observeres med fluorescens mikroskopi som de er utsatt for xenobiotic oval forbindelser i sanntid. Denne eksperimentell design tillater gjentatte målinger i samme celle, slik at hver celle etablerte baseline som sin egen kontroll. Den timelige høyoppløselig som gis av live-celle tenkelig er velegnet for påvisning av oksidativt hendelser, særlig de som er beskjedne i størrelse eller lagringsflyktig i naturen. I tillegg til å være både sensitive og bestemte å deres målmolekyler, kan fluorescens av noen av disse sensorene begeistret med to bølgelengder av lys. Dette fenomenet lar fluorescerende utslipp uttrykkes som et forhold, som tillater dømmekraft signal endringer forbundet med autentisk sensor svar fra de som forårsakes av gjenstander som variasjoner i sensor uttrykk, celle tykkelse, lampe intensitet, photobleaching og følsomhet fluorescens detektor²⁶. En annen fordel av fluorogenic sensorer er at de kan være målrettet mot bestemte mobilnettet avdelinger, skape et nivå av romlig oppløsning som er uovertruffen av konvensjonelle metoder^25,26,27.

Familien genetisk kodet sensor basert på grønne fluorescerende protein (GFP) har blitt utviklet og preget rapport om en rekke fysiologiske markører, inkludert pH, temperatur, kalsium konsentrasjon og ATP/ADP forholdet^{25 ,28,29,30,31}. Inkludert blant disse er sensorer glutation redoks potensielle (E_GSH) og hydrogenperoksid (H₂O₂). Mens disse sensorer ble utviklet for programmer i redoks biologi og fysiologi, har de også blitt tilpasset for å studere xenobiotic oval-indusert oksidativt stress. Spesielt beskriver protokollen skissert her bruken av E_GSH sensoren roGFP2 og H₂O₂ sensoren HyPer.

roGFP2 rapporter om redoks potensialet i intracellulær redusert og oksidert glutathione (GSH/GSSG) gjennom en redoks stafett med glutation peroxidase (GPx), glutaredoxin (Grx) og glutation reduktase (GR) (figur 1)^{25, 32 , 33}. glutation er den dominerende mobilnettet antioksidant molekylet og finnes hovedsakelig i formen (GSH) i millimolar konsentrasjoner i stoffer^25,34. Mens E_GSH ikke er koblet til noen funksjonell resultat, er det anerkjent som en viktig indikator for intracellulær oksidativt status³⁴. En relativt liten økning i konsentrasjonen av GSSG resulterer i en økning i E_GSH som oppdages av roGFP2. Like viktig, overvåking av E_GSH bruker roGFP2 i xenobiotic oval eksponeringer kan potensielt avsløre mye om virkningsmekanismen på flere punkter i redoks stafetten og tilknyttede pathways, som pentose fosfat overføre (figur 1 )³⁵. Andre sensoren diskutert her, HyPer, er en intracellulær H₂O₂ sonde avledet fra innsetting av gule fluorescerende protein (YFP) regulatoriske domenet av bakteriell H₂O₂-sensitive transkripsjon faktor OxyR1³⁶. Selv om det har tidligere vært ansett en ødeleggende reaktive oksygen mellomliggende, er H₂O₂ stadig mer anerkjent som en viktig intracellulær signalnettverk molekyl under fysiologiske forhold^{37, 38}, antyder at ukjent roller for H₂O₂ finnes i toksikologi også. For eksempel kan overflødig H₂O₂ indusert av en xenobiotic oval eksponering være en forløper til feilregulering cellular signal eller en endring i bioenergi.

Begge genetisk kodet fluorogenic sensorer har vært uttrykt i flere etablerte cellelinjer, inkludert menneskelige epidermoid karsinom celle linjen A431 og human bronkial epithelial celle linje BEAS-2B, å observere endringer i E_GSH og H₂ O₂ svar til en rekke toksikologiske eksponeringer. Disse omfatter gass forurensning (ozon³⁵), løselig komponenter av svevestøv (1,2 naphthoquinone^39,40 og sink⁴¹) og nikkel nanopartikler (upubliserte data). Disse studiene representerer bare en undergruppe av de mulige anvendelser av disse to sensorer. En celle type som kan motta og uttrykke DNA av disse sensorene gjennom konvensjonelle molekylærbiologi teknikker kan teoretisk brukes til å vurdere effekten av xenobiotics mistanke om å endre mobilnettet oksidativt tilstanden. Hittil har har én eller flere av disse sensorer vært uttrykk i ulike prokaryoter og eukaryoter, inkludert flere pattedyr, anlegg, bakteriell og gjær celle typer^25,26,36,42. Avlesning for både E_GSH og H₂O₂ er en endring i intensiteten av fluorescens slippes ut på 510 nm på eksitasjon med 488 og 404 nm lys. Denne metoden er vidt anvendelig over fluorometric plattformer, inkludert ulike typer mikroskopi (AC confocal og wide-feltet) og plate lesere. Metoden presenteres her kan følsom og bestemt observasjon av intracellulær E_GSH og H₂O₂ i i vitro toksikologiske systemer.

Protocol

1. forberedelse av celler Merk: Denne fremgangsmåten beskriver den lentiviral signaltransduksjon en udødeliggjort cellen linje (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) å uttrykke ønsket reporteren (roGFP2 eller HyPer). Andre celletyper linjer og/eller metoder for genoverføring, inkludert transfection, kan benyttes så lenge de resulterer i en grad av reporteren uttrykk til å visualisere et tilstrekkelig antall sensor-uttrykke celler per synsfelt (vanligvis 5-10 celler). Hvis bruker transfection metod…

Representative Results

Bruk av roGFP2 og HyPer oppdage endringer i EGSH og intracellulær H2O2 er godt beskrevet tidligere25,36,42,43 , og er vist her. AC confocal bilder av celler som uttrykker roGFP2 på grunnlinjen og følgende tillegg av H2O2 og DTT vises i figur 2. Data fra bilder samlet gjennom …

Discussion

Bruk av roGFP2 og HyPer oppdage endringer i intracellulær E_GSH og H₂O₂henholdsvis har blitt godt beskrevet i forrige fysiologiske og toksikologiske studier ^{25,35,36 ,},^39,,^40,,^41,,^42,,⁴³. Protokollen skissert her rapportere…

Materials

roGFP2 Plasmid	University of Oregon	N/A	Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid	Evrogen	FP941
Hydrogen Peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	10708984001
9,10-Phenanthrenequinone	Sigma Aldrich	156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes	Ted Pella	14029-20
BEAS-2B cell line	American Type Culture Collection	CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium	Lonza	192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit	Lonza	192060
Excel	Microsoft Office Suite	N/A
NIS-Elements AR Imaging Software	Nikon	N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System	Nikon	N/A