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Recherche en cancérologie

Abordagens para avaliação de estresse oxidativo toxicológico usando sensores Fluorogenic geneticamente codificado de imagem

Published: February 07, 2018
doi:
10.3791/56945
, ,
1Department of Environmental Sciences and Engineering, Gillings School of Global Public Health,University of North Carolina at Chapel Hill, 2Environmental Public Health Division,National Health and Environmental Effects Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education

Summary

Este manuscrito descreve o uso de repórteres fluorogenic geneticamente codificado em um aplicativo de imagem latente da viver-pilha para o exame de estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Esta abordagem experimental oferece inigualável resolução spatiotemporal, sensibilidade e especificidade, evitando muitas das deficiências dos métodos convencionais utilizados para a detecção de estresse oxidativo toxicológico.

Abstract

Enquanto o estresse oxidativo é um mecanismo comumente citado toxicológico, métodos convencionais para estudá-lo sofrem uma série de deficiências, incluindo a destruição da amostra, introdução de artefatos potenciais e uma falta de especificidade para a reativa espécie em questão. Assim, há uma necessidade atual no campo da toxicologia de métodos não-destrutivos, sensíveis e específicos que pode ser usado para observar e quantificar as perturbações redox intracelular, mais comumente referidas como estresse oxidativo. Aqui, apresentamos um método para o uso de dois sensores fluorogenic geneticamente codificado, roGFP2 e HyPer, para ser usado em estudos de imagiologia viver-pilha para observar respostas oxidativas induzida por xenobiótico. roGFP2 se equilibra com potencial de redox da glutationa (EGSH), enquanto HyPer detecta diretamente o peróxido de hidrogênio (H2O2). Ambos os sensores podem ser expressa em vários tipos de célula através de transfeccao ou transdução e podem ser direcionados para compartimentos celulares específicos. O mais importante, viver-pilha microscopia usando estes sensores oferece alta resolução espacial e temporal que não é possível usar os métodos convencionais. Mudanças na intensidade da fluorescência monitorados em 510 nm serve como a leitura para ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado quando sequencialmente animado por 404 nm e 488 nm de luz. Esta propriedade faz com que ambos os sensores ratiometric, eliminando artefatos comuns da microscopia e corrigir as diferenças na expressão de sensor entre as células. Esta metodologia pode ser aplicada através de uma variedade de plataformas fluorométrica capazes de emissões emocionantes e coleta em comprimentos de onda prescritos, tornando-o adequado para uso com sistemas de imagem confocal, microscopia de campo amplo convencional e placa leitores. Ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado utilizaram-se em uma variedade de tipos de células e estudos toxicológicos para monitorar celular EGSH e a H2O2 geração em tempo real. Descritas aqui, é um método padronizado que é amplamente adaptável em plataformas fluorométrica de aplicação do roGFP2 e HyPer nas avaliações toxicológicas de viver-pilha de estresse oxidativo e tipos de células.

Introduction

O termo “estresse oxidativo” é frequentemente citado como um mecanismo em toxicologia, mas raramente é este termo descrito especificamente. Estresse oxidativo pode se referir a vários processos intracelulares, incluindo a geração de espécies reativas de oxigênio, danos causados pelos radicais livres, a oxidação de moléculas antioxidantes, e mesmo a ativação de sinalização específicas cascatas. Uma ampla gama de contaminantes ambientais1,2 e3,de agentes farmacêuticos4 foram documentadas para induzir o estresse oxidativo por qualquer ação direta do composto xenobióticos em si5 ,6 ou secundariamente por produção de espécies oxidantes como parte de uma resposta celular7,8,9,10. Portanto, é de grande interesse na toxicologia com precisão observar e caracterizar os processos oxidativos, levando a resultados adversos. Métodos convencionais de medição de estresse oxidativo envolvem identificação de biomoléculas oxidada11,12,13,14,15 ou antioxidantes16 ,17,18,19,20, ou medição direta de espécies reactivas se21,22,23, 24. No entanto, esses métodos normalmente exigem rompimento celular, que muitas vezes consome a amostra, elimina a resolução espacial e potencialmente introduz artefatos25. O desenvolvimento de métodos mais sensíveis e específicos para a detecção de espécies oxidantes e marcadores de estresse oxidativo é amplamente aplicável para a investigação dos efeitos adversos da exposição xenobióticos.

Microscopia de viver-pilha usando uma nova geração de sensores fluorogenic geneticamente codificado tem emergido como uma poderosa ferramenta para monitorizar o estado redox intracelular de células vivas. Estes sensores são normalmente expressos usando um vetor sob o controle de um promotor viral é introduzido através de metodologias de transfecção ou transdução. Eficiência elevada expressão não é necessária, pois células expressando o sensor fluorescente podem ser facilmente identificadas visualmente. Para as avaliações toxicológicas, celulas que expressam estes sensores podem ser observadas usando microscopia de fluorescência, como eles são expostos a compostos xenobióticos em tempo real. Este projeto experimental permite medições repetidas na mesma cela, permitindo que a linha de base estabelecida de cada célula atuar como seu próprio controle. A alta resolução temporal, conferida pela imagem latente da viver-pilha é well-suited para a detecção de eventos oxidativos, particularmente aqueles que são modestos em magnitude ou transiente na natureza. Além de ser sensível e específico para suas moléculas-alvo, a fluorescência de alguns destes sensores pode ser excitada usando dois comprimentos de onda da luz. Este fenômeno permite a emissão fluorescente ser expressa como uma razão, que permite o discernimento do sinal alterações associadas com respostas de autêntica sensor de aqueles causados por artefatos tais como variações na expressão de sensor, espessura de célula, lâmpada intensidade, fotobranqueamento e sensibilidade do detector de fluorescência26. Outra vantagem do uso de sensores fluorogenic é que eles podem ser direcionados para compartimentos celulares específicos, criando um nível de resolução espacial que é inigualável por métodos convencionais25,26,27.

Uma grande família de sensores geneticamente codificado com base na proteína verde fluorescente (GFP) foram desenvolvidos e caracterizados para relatório sobre uma ampla variedade de marcadores fisiológicos, incluindo pH, temperatura, concentrações de cálcio e a relação ATP/ADP25 ,28,29,30,31. Estão incluídos entre esses sensores do potencial redox glutationa (EGSH) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Enquanto estes sensores foram desenvolvidos para aplicações em biologia redox e fisiologia, eles também foram adaptados para estudar o estresse oxidativo induzido por xenobiótico. Especificamente, o protocolo descrito aqui descreve o uso da roGFP2 de sensor EGSH e o sensor de2 H2O HyPer.

roGFP2 informa o potencial redox intracelular reduzida e oxidada glutationa (GSH/GSSG) através de um relé de redox envolvendo glutationa peroxidase (GPx), Glutarredoxina (Grx) e glutationa redutase (GR) (Figura 1)25, 32 , 33. glutationa é a molécula antioxidante celular predominante e está presente principalmente em sua forma reduzida (GSH) em concentrações milimolar no citosol25,34. Enquanto EGSH não tem sido associada a qualquer resultado funcional, é reconhecido como um importante indicador de status oxidativo intracelular34. Um relativamente pequeno aumento na concentração de GSSG resulta em um aumento EGSH é detectável por roGFP2. Igualmente importante, monitoramento de EGSH usar roGFP2 durante exposições xenobióticas pode potencialmente revelar muito sobre o mecanismo de ação em vários pontos do relé de redox e caminhos associados, tais como o fosfato de pentose derivação (Figura 1 )35. O segundo sensor discutido aqui, HyPer, é uma intracelular sonda H2O2 derivada a inserção de proteína fluorescente amarela (YFP) no domínio regulamentar de bacteriana H2O2-transcrição sensível fator OxyR136. Embora anteriormente foi considerado um prejudicial oxigênio reativo intermediário, H2O2 está cada vez mais sendo reconhecido como uma importante molécula de sinalização intracelular sob condições fisiológicas37, 38, sugerindo que funções não reconhecidas para H2O2 existir em toxicologia também. Por exemplo, excesso H2O2 induzido por uma exposição de xenobióticas pode ser um precursor de desregulagem na sinalização celular, ou uma mudança na Bioenergética.

Ambos os sensores fluorogenic geneticamente codificado foram expressas em várias linhagens celulares estabelecidas, incluindo a linhagem de células de carcinoma epidermoide humana A431 e a linha de células epiteliais brônquicas humanas BEAS-2B, para observar alterações no EGSH e H2 O2 em resposta a uma variedade de riscos toxicológicos. Estes incluem gases poluentes (ozônio35), componentes solúveis de matéria particulada (1,2 naftoquinona39,40 e zinco41) e nanopartículas de níquel (dados não publicados). Estes estudos representam apenas um pequeno subconjunto das possíveis aplicações destes dois sensores. Teoricamente, qualquer tipo de célula que é capaz de receber e expressar o DNA destes sensores através de técnicas convencionais de biologia molecular pode ser utilizado para avaliar os efeitos dos xenobióticos, suspeitados-se de alterar o estado oxidativo celular. Até à data, um ou mais destes sensores foi expressa em vários procariotas e eucariotas, incluindo vários mamíferos, planta, bactérias e levedura célula tipos25,26,36,42. A leitura de ambos EGSH e H2O2 sensores é uma mudança na intensidade da fluorescência emitida em 510 nm com excitação com luz de 404 e 488 nm. Este método é amplamente adaptável em plataformas fluorométrica, incluindo vários tipos de microscopia (confocal e campo amplo) e leitores de placa. O método apresentado aqui permite a observação sensível e específica de intracelular EGSH e H2O2 em vitro sistemas toxicológicos.

Protocol

1. preparação das células Nota: Este procedimento descreve a transdução Lentivirus de uma linhagem de células imortalizado (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) para expressar o repórter desejado (roGFP2 ou HyPer). Outras linhas/tipos de células e/ou métodos de transferência de genes, incluindo transfeccao, podem ser utilizados desde que resultam em um nível de expressão do repórter adequada para visualizar um número suficiente de sensor-expressando células por campo de visão (tipicament…

Representative Results

O uso de roGFP2 e HyPer em detectar alterações EGSH e intracelular H2O2 tem sido bem descrito anteriormente25,36,42,43 e é demonstrado aqui. Imagens confocal de células expressando roGFP2 na linha de base e seguir adição de H2O2 e TDT são mostradas na Figura 2. Dados de i…

Discussion

O uso de roGFP2 e HyPer na detecção de alterações em intracelular EGSH e H2O2, respectivamente, foi bem descrito em anteriores estudos fisiológicos e toxicológicos 25,35,36 ,39,40,41,42,43. O protocolo descrito aqui r…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostaria de agradecer Katelyn Lavrich para obter assistência com delineamento experimental e edições de manuscrito.

Materials

roGFP2 Plasmid University of Oregon N/A Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid Evrogen FP941
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009
Dithiothreitol Sigma Aldrich 10708984001
9,10-Phenanthrenequinone Sigma Aldrich 156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes Ted Pella 14029-20
BEAS-2B cell line American Type Culture Collection CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium Lonza 192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Excel  Microsoft Office Suite N/A
NIS-Elements AR Imaging Software Nikon N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System Nikon N/A
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Keywords: Genetically-encoded Fluorogenic SensorsToxicological Oxidative StressRedox HomeostasisConfocal MicroscopyEnvironmental ControlsReal-time AcquisitionStage-top Environmental ChamberNumerical ApertureWide-field Fluorescence Illumination
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Corteselli, E. M., Samet, J. M., Gibbs-Flournoy, E. A. Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors. J. Vis. Exp. (132), e56945, doi:10.3791/56945 (2018).
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