Imaging подходы для оценки токсикологической оксидативного стресса, используя генетически закодированный Fluorogenic датчики
Summary
Эта рукопись описывает использование генетически закодированный fluorogenic журналистам в приложении клеток для изучения ксенобиотик индуцированного окислительного стресса. Этот экспериментальный подход предлагает беспрецедентную пространственно-временных разрешение, чувствительность и специфичность избегая многих недостатков традиционных методов, используемых для обнаружения токсикологические оксидативного стресса.
Abstract
Окислительный стресс является механизм часто цитируется токсикологические, обычные методы для его изучения страдают от ряда недостатков, включая разрушение образца, введение возможных артефактов и отсутствие специфики для реактивной виды участвуют. Таким образом существует в области токсикологии текущего необходимость неразрушающего, чувствительной и конкретные методы, которые могут использоваться для наблюдения и количественно внутриклеточные окислительно-восстановительные возмущений, чаще называют оксидативного стресса. Здесь мы представляем метод для использования двух датчиков генетически закодированный fluorogenic, roGFP2 и HyPer, чтобы использоваться тепловизионные исследования клеток соблюдать ксенобиотик индуцированного окислительного ответы. roGFP2 уравновешивает с потенциальных редокс глутатион (GSHE), в то время как HyPer непосредственно обнаруживает перекиси водорода (H2O2). Оба датчика может быть выражено в различные типы клеток через трансфекции или трансдукции и могут быть предназначены для конкретных клеточных отсеков. Самое главное микроскопия живой клетки, используя эти датчики предлагает высоким пространственным и временным разрешением, это не возможно с использованием обычных методов. Изменения в интенсивности флуоресценции, мониторинг на 510 нм служит как индикация для обоих датчиков генетически закодированный fluorogenic когда последовательно возбуждается 404 Нм и 488 нм свет. Это свойство делает обоих датчиков ratiometric, устранение общих микроскопии артефакты и устранения различий в выражении датчика между ячейками. Эта методология может применяться в различных флуориметрический платформы способны захватывающие и собирая выбросов на установленных длин волн, что делает его пригодным для использования с конфокальный тепловизионных систем, обычных-поля микроскопии и пластины читатели. Оба датчика генетически закодированный fluorogenic были использованы в различных типах клеток и токсикологических исследований для мониторинга сотовых EГШ и H2O2 поколения в режиме реального времени. Здесь приводится стандартизированный метод, который широко адаптируемым различных типов клеток и флуориметрический платформ для применения roGFP2 и HyPer в токсикологические оценки клеток оксидативного стресса.
Introduction
Термин «оксидативного стресса» часто приводится в качестве механизма в токсикологии, пока редко это термин описанные. Оксидативный стресс может ссылаться несколько внутриклеточных процессов, в том числе генерации активных форм кислорода, повреждения, вызванные свободными радикалами, окисления молекул антиоксидант, и даже активации конкретные сигнальные каскады. Широкий спектр экологических загрязнителей1,2 и3,фармацевтических агентов4 были задокументированы, чтобы вызвать оксидативного стресса, либо прямого действия комплекса ксенобиотиков, сам5 ,6 или вторично производство видов окислитель как часть клеточный ответ7,8,9,10. Именно поэтому большой интерес в токсикологии точно соблюдать и характеризуют окислительных процессов, ведущих к неблагоприятных исходов. Обычные методы измерения оксидативного стресса включают выявление окисленных биомолекул11,12,13,,1415 или антиоксидантов16 ,17,18,19,20, или прямого измерения реактивной видов, сами,21,,2223 24. Однако эти методы, как правило, требуют сотовой срыв, который часто использует образец, устраняет пространственное разрешение и потенциально представляет артефакты25. Развитие более чувствительной и конкретных методов для выявления видов окислителя и маркеры оксидативного стресса является широко применимо к расследованию неблагоприятных эффектов ксенобиотиков воздействия.
Микроскопия клеток, используя новое поколение генетически закодированный fluorogenic датчиков стала мощным инструментом для мониторинга внутриклеточные окислительно-восстановительного состояния живых клеток. Эти датчики обычно выражаются с помощью вектора под контролем промотора вирусных, который вводится через трансфекции или трансдукции методологий. Высокая экспрессия эффективность не являются необходимыми, поскольку клетки, выражая флуоресцентные датчик может быть легко идентифицированы визуально. Токсикологические оценки клетки, выражая эти датчики можно наблюдать с помощью микроскопии флуоресцирования, как они подвергаются воздействию ксенобиотиков соединений в реальном времени. Этот экспериментальный дизайн допускает повторные измерения в той же ячейке, позволяя каждой ячейки базовых показателей, установленных в качестве своего собственного управления. Высокая временное разрешение, обеспечиваемой клеток хорошо подходит для обнаружения окислительного события, особенно те, которые имеют скромные масштабы или переходный характер. Помимо чувствительных и конкретным для их молекулы-мишени, флуоресценции некоторых из этих датчиков может быть взволнован с помощью двух длин волн света. Это явление позволяет Флуоресцентные выбросов выражается как отношение, которое позволяет проницательность сигнал изменения, связанные с подлинными датчик ответов от тех, которые вызваны артефакты как вариации в датчик выражение, толщина клеток, лампа интенсивность, Фотообесцвечивание и чувствительности детектор флуоресценции26. Еще одним преимуществом использования датчиков fluorogenic является, что они могут быть предназначены для конкретных клеточных отсеков, создания уровня пространственного разрешения, которая имеет себе равных среди обычных методов25,,2627.
Большое семейство генетически закодированный датчики, основанные на Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) были разработаны и охарактеризовать доклад о широкий спектр физиологических маркеров, в том числе рН, температуры, концентрации кальция и соотношение АТФ/ADP25 ,–28,–29,–30,–31. Среди них включены датчики глутатион redox потенциал (EGSH) и пероксида водорода (H2O2). Хотя эти датчики были разработаны для применения в редокс биологии и физиологии, они также были адаптированы для изучения ксенобиотик индуцированного окислительного стресса. В частности Протокол, изложенные здесь описывает использование EGSH датчик roGFP2 и H2O2 датчика HyPer.
roGFP2 сообщает о redox потенциал внутриклеточного восстановленного и окисленного глутатиона (GSH/GSSG) через редокс реле, с участием глутатионпероксидазы (GPx) и glutaredoxin (Grx), глутатионредуктазы (гр) (рис. 1)25, 32 , 33. глутатион является преобладающим сотовой антиоксидантное молекулы и присутствует главным образом в сокращенной форме (GSH) в millimolar концентрациях в цитозоль25,34. В то время как EГШ не был связан с любых функциональных результатов, он признан важным показателем внутриклеточных окислительных статус34. Относительно небольшое увеличение концентрации GSSG приводит к увеличению числа EGSH , обнаруживаемых roGFP2. Не менее важно, мониторинг EGSH с помощью roGFP2 во время ксенобиотиков воздействия может потенциально выявить много о механизм действия в нескольких точках в редокс реле и связанные пути, такие как фосфат пентозы шунта (Рисунок 1 )35. Второй датчик, обсуждаемых здесь, HyPer, является внутриклеточным H2O2 зонд, производный от включения желтого флуоресцирующего белка (рекламы ЯФП) в область регулирования бактериальных H2O2-чувствительных транскрипции фактор OxyR136. Хотя ранее было сочтено повреждения реактивнооксигенных промежуточных, H2O2 все шире признается как важный внутриклеточных сигнальной молекулы при физиологических условиях37, 38, предполагая, что неизвестный роли для H2O2 существуют в токсикологии, а также. Например избыток H2O2 индуцированные ксенобиотиков воздействия может быть прекурсором для регуляции клеточной сигнализации или сдвиг в биоэнергетике.
Оба датчика генетически закодированный fluorogenic были выражены в нескольких установленных клеточные линии, включая линии человека плоскоклеточный рак клетки A431 и линии эпителиальных клеток человека бронхиальной Беас 2B, чтобы наблюдать изменения вГШ E и H2 O2 в ответ на различных токсикологических воздействий. К ним относятся газообразных загрязнителей (35озона), растворимых компонентов твердых частиц (1,2 нафтохиноновое39,40 и цинка41), и никель наночастиц (неопубликованные данные). Эти исследования представляют собой лишь небольшое подмножество возможных применений этих двух датчиков. Теоретически любой тип клеток, которое способно получать и выражая ДНК этих датчиков через обычные молекулярные методы биологии могут быть использованы для оценки последствий ксенобиотиков, предположительно изменить состояние клеточных окислительного. На сегодняшний день, один или более из этих датчиков была выражена в различных прокариот и эукариот, в том числе несколько млекопитающих, растений, бактериальных и дрожжевых клеток типы25,26,36,42. Индикация дляГШ E и H2O2 датчиков является изменение интенсивности флуоресценции излучается на 510 нм после возбуждения светом 488 и 404 Нм. Этот метод широко адаптируемым флуориметрический платформ, включая различные типы микроскопии (конфокальный и поля) и плиты читателей. Представленные здесь метод позволяет для чувствительной и конкретные наблюдения внутриклеточногоGSH E и H2O2 в vitro токсикологические систем.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование roGFP2 и HyPer в обнаружение изменений в внутриклеточногоGSH E и H2O2, соответственно, была хорошо описана в предыдущем физиологические и токсикологические исследования 25,35,36 ,,39<sup class="xref…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Кейтлин Lavrich за помощь в экспериментальный дизайн и редактирование рукописей.
Materials
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
References
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
- Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
- Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
- Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
- Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
- Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
- Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
- Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
- Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
- Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P. Gel-based methods in redox proteomics. Biochim Biophys Acta. 1840, 830-837 (2014).
- Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user’s perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
- Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
- Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
- Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
- Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
- Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
- Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
- Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
- Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
- Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
- Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
- Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxid Redox Signal. 13, 621-650 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
- Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
- Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
- Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
- Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
- Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
- Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
- Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
- Cheng, W. -. Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
- Cheng, W. -. Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
- Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
- Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
- Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
- Hou, J. -. T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
- Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
- Cheng, W. -. Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
- Wages, P. A., Cheng, W. -. Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).
