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Recherche en cancérologie

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

Published: February 07, 2018
doi:
10.3791/56945
, ,
1Department of Environmental Sciences and Engineering, Gillings School of Global Public Health,University of North Carolina at Chapel Hill, 2Environmental Public Health Division,National Health and Environmental Effects Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education

Summary

Este manuscrito describe el uso de reporteros fluorógenos genéticamente codificados en una aplicación de imágenes de células vivas para el examen de estrés oxidativo inducido por xenobióticos. Este enfoque experimental ofrece inigualable resolución espaciotemporal, la sensibilidad y especificidad evitando muchas de las deficiencias de los métodos convencionales usados para la detección de estrés oxidativo toxicológica.

Abstract

Mientras que el estrés oxidativo es un mecanismo toxicológico comúnmente citado, los métodos convencionales de estudio sufren una serie de deficiencias, incluyendo la destrucción de la muestra, introducción de posibles artefactos y la falta de especificidad para el reactivo especies implicadas. Por lo tanto, es una necesidad actual en el campo de la toxicología de métodos no destructivos, sensibles y específicos que puede ser utilizado para observar y cuantificar las perturbaciones redox intracelular, más comúnmente contempladas como estrés oxidativo. Aquí, presentamos un método para el uso de dos sensores fluorógenos codificado genéticamente, roGFP2 y HyPer, para ser utilizado en estudios de imágenes de células vivas para observar respuesta oxidativa inducida por xenobióticos. roGFP2 se equilibra con el potencial redox glutatión (GSHde E), mientras que el HyPer detecta directamente el peróxido de hidrógeno (H2O2). Ambos sensores pueden ser expresadas en varios tipos de células mediante transfección o transducción y pueden ser dirigidas a compartimentos celulares específicos. Lo más importante, microscopía de células vivas usando estos sensores ofrece alta resolución espacial y temporal que no es posible usando métodos convencionales. Cambios en la intensidad de fluorescencia controlados a 510 nm sirve como lectura para ambos sensores codificados genéticamente fluorógenos cuando excitados secuencialmente por 404 nm y 488 nm luz. Esta propiedad hace que ambos radiométrica de los sensores, eliminando artefactos comunes de microscopia y corregir las diferencias en la expresión del sensor entre las células. Esta metodología se puede aplicar en una variedad de plataformas fluorométrica capaces de emocionantes y que recoge las emisiones en las longitudes de onda prescritas, lo que es conveniente para el uso con sistemas de proyección de imagen confocales y microscopía de amplio campo convencional placa lectores. Ambos sensores fluorógenos genéticamente codificados se han utilizado en una variedad de tipos de células y estudios toxicológicos para monitorear celulares EGSH y H2O2 generación en tiempo real. Se describe aquí es un método estandarizado que es ampliamente adaptable fluorométrica plataformas para la aplicación de roGFP2 y HyPer en la evaluación toxicológica de células vivas de estrés oxidativo y tipos de la célula.

Introduction

Sin embargo, el término “estrés oxidativo” es citado con frecuencia como un mecanismo en toxicología, rara vez es este término se describe específicamente. El estrés oxidativo puede referirse a varios procesos intracelulares, incluyendo generación de especies reactivas del oxígeno, daño causado por los radicales libres, la oxidación de moléculas antioxidantes, y las cascadas de incluso la activación de la señalización específica. Una amplia gama de contaminantes ambientales1,2 y3,de agentes farmacéuticos4 se han documentado para inducir estrés oxidativo por cualquier acción directa del compuesto xenobiótico sí mismo5 ,6 o secundariamente por la producción de especies oxidantes como parte de una respuesta celular7,8,9,10. Por lo tanto es de gran interés en toxicología precisa observar y caracterizar los procesos oxidativos que conducen a resultados adversos. Los métodos convencionales de medición de estrés oxidativo incluyen identificación de biomoléculas oxidado11,12,13,14,15 o antioxidantes16 ,17,18,19,20, o la medición directa de las especies reactivas se21,22,23, 24. Sin embargo, estos métodos requieren típicamente trastornos celulares, que a menudo consume la muestra, elimina la resolución espacial y potencialmente introduce artefactos25. El desarrollo de métodos más sensibles y específicos para la detección de especies antioxidantes y marcadores de estrés oxidativo es ampliamente aplicable a la investigación de los efectos adversos de la exposición xenobiótico.

Microscopía de células vivas usando una nueva generación de sensores codificados genéticamente fluorógenos ha surgido como una poderosa herramienta para monitorear el estado redox intracelular de las células vivas. Estos sensores se expresan normalmente usando un vector bajo el control de un promotor viral que se introduce a través de metodologías de la transfección o transducción. Eficiencia alta expresión no es necesaria, ya que las células que expresan el sensor fluorescente pueden ser fácilmente identificadas visualmente. Para la evaluación toxicológica, se observan las células que expresan estos sensores utilizando microscopía de fluorescencia están expuestos a los compuestos xenobióticos en tiempo real. Este diseño experimental permite mediciones repetidas en la misma célula, permitiendo que la base establecida de cada célula actuar como su propio control. La alta resolución temporal que brinda imágenes de células vivas es muy adecuada para la detección de eventos oxidativos, especialmente los que son modestos en magnitud o transitorio en naturaleza. Además de ser sensible y específico para sus moléculas blanco, la fluorescencia de algunos de estos sensores puede ser excitada con dos longitudes de onda de la luz. Este fenómeno permite la emisión fluorescente a expresarse como un cociente, que permite el discernimiento de los cambios de señal asociados con respuestas de auténtico sensor de ésos causados por artefactos tales como variaciones en la expresión de sensor, espesor de célula, lámpara intensidad, fotoblanqueo y la sensibilidad de la fluorescencia detector26. Otra ventaja del uso de sensores fluorógenos es que puede orientarse a compartimentos celulares específicos, creando un nivel de resolución espacial que es incomparable por métodos convencionales25,26,27.

Una gran familia de sensores codificados genéticamente basados en proteína fluorescente verde (GFP) se han desarrollado y caracterizado al informe sobre una amplia variedad de marcadores fisiológicos, incluyendo el pH, temperatura, concentraciones de calcio y la relación ATP/ADP25 ,28,29,30,31. Entre ellas, son sensores del potencial redox de glutatión (GSHde E) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Mientras que estos sensores fueron desarrollados para aplicaciones en fisiología y biología redox, también han sido adaptados para el estudio de estrés oxidativo inducido por xenobióticos. Específicamente, el protocolo descrito aquí describe el uso de la roGFP2 de sensor EGSH y el H2O2 sensor HyPer.

roGFP2 informa sobre el potencial redox intracelular glutation reducido y oxidado (GSH/GSSG) a través de un relé de redox que implican reductasas (Grx) y glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión reductasa (GR) (figura 1)25, 32 , 33. glutatión es la molécula predominante antioxidante celular y está presente principalmente en su forma reducida (GSH) en concentración milimolar en el citosol25,34. Mientras EGSH se ha ligado no a un resultado funcional, se reconoce como un importante indicador del estado oxidativo intracelular34. Un aumento relativamente pequeño en la concentración de GSSG se traduce en un aumento en EGSH que es detectable por roGFP2. Igualmente importante, seguimiento de EGSH usando roGFP2 durante exposiciones xenobióticos puede potencialmente revelar mucho sobre el mecanismo de acción en varios puntos en el relé de redox y desviación de caminos asociados, tales como el fosfato de pentosa (figura 1 )35. El segundo sensor aquí, HyPer, es un intracelular H2O2 punta de prueba derivada de la inserción de proteína fluorescente amarilla (YFP) en el dominio regulador de bacteriana H2O2-transcripción sensible factor de OxyR136. Aunque se ha previamente considerado un dañino oxígeno reactivo intermedio, H2O2 se está reconociendo cada vez más como una importante molécula de señalización intracelular bajo condiciones fisiológicas37, 38, lo que sugiere que existen funciones no reconocidas para H2O2 en toxicología, así. Por ejemplo, exceso H2O2 inducida por una exposición xenobiótico podría ser un precursor de la desregulación en la señalización celular o un cambio en la bioenergética.

Ambos sensores fluorógenos genéticamente codificados se han expresado en varias líneas celulares establecidas, incluyendo la línea celular de carcinoma epidérmico humano A431 y la línea de células epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B, para observar los cambios en EGSH y H2 O2 en respuesta a una variedad de riesgos toxicológicos. Estos incluyen gases contaminantes (ozono35), componentes solubles de partículas (1,2 naftoquinona39,40 y zinc41) y nanopartículas de níquel (datos no publicados). Estos estudios representan sólo un pequeño subconjunto de las posibles aplicaciones de estos dos sensores. Teóricamente, cualquier tipo de célula que es capaz de recibir y expresar el ADN de estos sensores a través de técnicas de biología molecular convencionales puede ser utilizado para evaluar los efectos de los xenobióticos sospechadas de alterar el estado oxidativo celular. Hasta la fecha, uno o más de estos sensores se ha expresado en diversos procariotas y eucariotas, incluyendo varios mamíferos, planta, bacterias y levadura celular tipos25,26,36,42. La lectura EGSH y H2O2 sensores es un cambio en la intensidad de fluorescencia emitida a 510 nm en la excitación con luz nm 488 y 404. Este método es ampliamente adaptable plataformas fluorométrico, incluyendo varios tipos de microscopía (confocal y campo amplio) y los lectores de la placa. El método aquí presentado permite observación sensible y específica de intracelular deGSH de E y H2O2 sistemas toxicológicos in vitro .

Protocol

1. preparación de las células Nota: Este procedimiento describe la transducción lentivirales de una línea celular inmortalizada (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) para expresar el reportero deseado (roGFP2 o HyPer). Pueden utilizarse otras líneas/tipos de células o métodos de transferencia de genes, incluyendo transfección, como resultado un nivel de expresión del periodista adecuada para visualizar un número suficiente de células expresando su sensor por campo de visión (típicamente 5-1…

Representative Results

El uso de roGFP2 y HyPer en la detección de cambios en EGSH e intracelular H2O2 ha sido bien descrito previamente25,36,42,43 y se demuestra aquí. Imágenes confocales de células que expresan roGFP2 en la línea de base y la siguiente adición de H2O2 y TDT se muestran en la figura 2</…

Discussion

El uso de roGFP2 y HyPer en la detección de cambios en el intracelular EGSH y H2O2, respectivamente, ha sido bien descrito en anteriores estudios fisiológicos y toxicológicas 25,35,36 ,39,40,41,42,43. El protocolo descri…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Katelyn Lavrich por asistencia con diseño experimental y edición del manuscrito.

Materials

roGFP2 Plasmid University of Oregon N/A Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid Evrogen FP941
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009
Dithiothreitol Sigma Aldrich 10708984001
9,10-Phenanthrenequinone Sigma Aldrich 156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes Ted Pella 14029-20
BEAS-2B cell line American Type Culture Collection CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium Lonza 192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Excel  Microsoft Office Suite N/A
NIS-Elements AR Imaging Software Nikon N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System Nikon N/A
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Keywords: Genetically-encoded Fluorogenic SensorsToxicological Oxidative StressRedox HomeostasisConfocal MicroscopyEnvironmental ControlsReal-time AcquisitionStage-top Environmental ChamberNumerical ApertureWide-field Fluorescence Illumination
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Citer Cet Article
Corteselli, E. M., Samet, J. M., Gibbs-Flournoy, E. A. Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors. J. Vis. Exp. (132), e56945, doi:10.3791/56945 (2018).
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