Imaging metoder för bedömningar av toxikologiska oxidativ Stress använder genetiskt-kodade Fluorogenic sensorer
Summary
Detta manuskript beskriver användningen av genetiskt-kodade fluorogenic reportrar i ett program för live-cell imaging för undersökning av xenobiotiska-inducerad oxidativ stress. Detta experimentella tillvägagångssätt erbjuder oöverträffad spatiotemporal upplösning, känslighet och specificitet samtidigt undvika många av bristerna i konventionella metoder som används för detektion av toxikologiska oxidativ stress.
Abstract
Oxidativ stress är en ofta citerade toxikologiska mekanism, lider konventionella metoder för att studera det av ett antal brister, inklusive förstörelsen av provet, införandet av potentiella artefakter och bristande specificitet för den reaktiva arter inblandade. Således finns det ett aktuellt behov inom toxikologi för icke-förstörande, känsliga och specifika metoder som kan användas för att observera och kvantifiera intracellulära redox störningar, mer allmänt kallas oxidativ stress. Här presenterar vi en metod för användning av två genetiskt-kodade fluorogenic sensorer, roGFP2 och HyPer, att användas i live-cell imaging studier för att iaktta xenobiotiska-inducerad oxidativ svaren. roGFP2 balanserar med den glutation redox potential (EGSH), medan HyPer direkt upptäcker väteperoxid (H2O2). Båda sensorerna kan uttryckas i olika celltyper via transfection eller transduktion och riktas till specifika cellulära fack. Viktigast av allt, erbjuder live-cell mikroskopi använda dessa sensorer hög rumsliga och temporal upplösning som inte är möjligt med konventionella metoder. Förändringar i fluorescensintensiteten övervakas på 510 nm serverar som avläsningen för både genetiskt-kodade fluorogenic sensorer när sekventiellt upphetsad av 404 nm och 488 nm ljus. Denna egenskap gör båda sensorer proportionerlig, eliminera gemensamma mikroskopi artefakter och korrigering för olikheter i sensorn uttryck mellan celler. Denna metod kan appliceras över en mängd olika fluorometric plattformar kan spännande och samlande utsläpp vid de föreskrivna våglängder, vilket gör den lämplig för användning med confocal bildsystem, konventionella wide-fältet mikroskopi och plattan läsare. Både genetiskt-kodade fluorogenic sensorer har använts i en mängd olika celltyper och toxikologiska studier för att övervaka cellulära EGSH och H2O2 generation i realtid. Beskrivs här är en standardiserad metod som är mycket anpassningsbar över celltyper och fluorometric plattformar för tillämpningen av roGFP2 och HyPer i live-cell toxikologiska bedömningar av oxidativ stress.
Introduction
Termen ”oxidativ stress” omnämns ofta som en mekanism i toxikologi, men är sällan denna term som beskrivs specifikt. Oxidativ stress kan avse flera intracellulära processer, inklusive generation av reaktiva syreradikaler, skador orsakade av fria radikaler, oxidation av antioxidant molekyler, och även aktivering av specifika signalering kaskad. Ett brett utbud av miljöföroreningar1,2 och farmaceutiska medel3,4 har dokumenterats för att inducera oxidativ stress genom antingen direkt aktion av xenobiotiska föreningen själv5 ,6 eller sekundärt genom produktionen av antioxidant arter som en del av ett cellulärt svar7,8,9,10. Det är därför av stort intresse i toxikologi att noggrant iaktta och karaktärisera de oxidativa processer som leder till negativa resultat. Konventionella metoder för mätning av oxidativ stress innebär identifiering av oxiderade biomolekyler11,12,13,14,15 eller antioxidanter16 ,17,18,19,20, eller direkt mätning av reaktiva arter själva21,22,23, 24. Dessa metoder kräver dock normalt cellulära störning, som ofta förbrukar provet, eliminerar rumslig upplösning och potentiellt introducerar artefakter25. Utvecklingen av mer känsliga och specifika metoder för detektion av oxidanten arter och markörer för oxidativ stress är allmänt tillämplig på utredningen av de negativa effekterna av xenobiotiska exponering.
Live-cell mikroskopi med hjälp av en ny generation av genetiskt-kodade fluorogenic sensorer har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för att övervaka intracellulära redox status av levande celler. Dessa sensorer uttrycks vanligen använder en vector under kontroll av en viral arrangören som införs via transfection eller transduktion metoder. Hög uttryck effektivitetsvinster är inte nödvändiga, eftersom celler som uttrycker fluorescerande sensorn lätt kan identifieras visuellt. För toxikologiska bedömningar, kan celler som uttrycker dessa sensorer observeras med fluorescensmikroskopi som de utsätts för xenobiotiska föreningar i realtid. Denna experimentella design tillåter upprepade mätningar i samma cell, så att alla cellens etablerade baslinjen till fungera som sin egen kontroll. Den höga temporal upplösning genom live-cell imaging är väl lämpad för detektion av oxidativ händelser, särskilt sådana som är blygsam i storleksordning eller övergående natur. Förutom att vara både känsligt och specifikt till deras målmolekyler, kan fluorescensen av några av dessa sensorer vara upphetsad med hjälp av två våglängder av ljus. Detta fenomen kan fluorescerande utsläpp uttrycks som en kvot, som tillstånd urskillning av signalförändringar i samband med autentiska sensor svaren från de som orsakas av artefakter såsom variationer i sensorn uttryck, cell tjocklek, lampa intensitet, fotoblekning och känslighet av fluorescens detektorn26. En annan fördel av användningen av fluorogenic sensorer är att de kan riktas till specifika cellulära fack, att skapa en nivå av rumslig upplösning som är oöverträffad av konventionella metoder25,26,27.
En stor familj av genetiskt-kodade sensorer baserat på grönt fluorescerande protein (GFP) har utvecklats och kännetecknas till rapport om en lång rad fysiologiska markörer, inklusive pH, temperatur, kalcium koncentrationer och ATP/ADP kvoten25 ,28,29,30,31. Bland dessa ingår sensorer av glutation redox potential (EGSH) och väteperoxid (H2O2). Medan dessa sensorer har utvecklats för applikationer i redox biologi och fysiologi, har de även anpassats till studera xenobiotiska-inducerad oxidativ stress. Specifikt, beskriver det protokoll som beskrivs här användningen av de EGSH sensor roGFP2 och H2O2 sensorn HyPer.
roGFP2 rapporter om redoxpotential av intracellulära reducerade och oxiderade glutation (GSH/GSSG) genom en redox relä som involverar glutationperoxidas (GPx), glutaredoxin (Grx) och glutation reduktas (GR) (figur 1)25, 32 , 33. glutation är dominerande cellulär antioxidant molekyl och förekommer främst i dess reducerade form (GSH) i millimolar koncentrationer i det cytosol25,34. Medan EGSH inte har kopplats till något funktionellt resultat, är det erkänd som en viktig indikator på intracellulära oxidativ status34. En relativt liten ökning av koncentrationen av GSSG resulterar i en ökning av EGSH som detekteras av roGFP2. Lika viktigt, övervakning av EGSH använder roGFP2 under xenobiotiska exponeringar kan potentiellt avslöja mycket om verkningsmekanismen vid flera punkter i redox reläet och associerade vägar, såsom det pentosjäsande fosfatet shunt (figur 1 )35. Den andra sensor som diskuteras här, HyPer, är en intracellulär H2O2 sond härrör från införandet av gula fluorescerande protein (YFP) in i föreskrivande domänen för bakteriell H2O2-känsliga transkription faktorn OxyR136. Även om det har tidigare ansetts vara en skadliga reaktiva syre mellanliggande, är H2O2 alltmer att erkännas som en viktig intracellulära signalmolekyl under fysiologiska betingelser37, 38, vilket tyder på att okända roller för H2O2 finns i toxikologi samt. Överflödigt H2O2 induceras av en xenobiotiska exponering kan exempelvis vara en föregångare till dysreglering i cellulär signalering eller en förskjutning i bioenergetik.
Både genetiskt-kodade fluorogenic sensorer har uttryckts i flera etablerade cellinjer, inklusive mänskliga epidermoid karcinom cell linjen A431 och raden mänsklig bronkial epitelial cell BEAS-2B, att observera ändringar i EGSH och H2 O2 som svar på en mängd olika toxikologiska exponeringar. Dessa inkluderar gasformiga föroreningar (ozon35), lösliga komponenter partiklar (1,2 naphthoquinone39,40 och zink41), och nickel nanopartiklar (opublicerade data). Dessa studier utgör endast en liten delmängd av de möjliga tillämpningarna av dessa två sensorer. Teoretiskt, vilken celltyp som kan ta emot och att uttrycka DNA av dessa sensorer genom konventionella molekylärbiologiska tekniker kan utnyttjas för att bedöma effekterna av xenobiotika misstänks ändra cellulära oxidativ staten. Hittills har har en eller flera av dessa sensorer uttryckts i olika prokaryoter och Eukaryoter, inklusive flera däggdjur, växt, bakterier och jäst cell typer25,26,36,42. Utläsningen för både EGSH och H2O2 sensorer är en förändring i intensitet av fluorescens som avges på 510 nm vid excitation med 488 och 404 nm ljus. Denna metod är mycket anpassningsbar på fluorometric plattformar, inklusive olika typer av mikroskopi (confocal och wide-field) och plattan läsare. Metoden presenteras här tillåter för känsligt och specifikt observation av intracellulära EGSH och H2O2 i in vitro- toxikologiska system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användning av roGFP2 och HyPer att upptäcka förändringar i intracellulära EGSH och H2O2, respektive, har varit väl beskrivna i föregående fysiologiska och toxikologiska studier 25,35,36 ,39,40,41,42,43. Protokollet …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Katelyn Lavrich för hjälp med experimentell design och manuskript redigeringar.
Materials
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
References
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
- Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
- Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
- Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
- Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
- Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
- Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
- Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
- Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
- Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P. Gel-based methods in redox proteomics. Biochim Biophys Acta. 1840, 830-837 (2014).
- Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user’s perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
- Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
- Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
- Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
- Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
- Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
- Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
- Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
- Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
- Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
- Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
- Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxid Redox Signal. 13, 621-650 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
- Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
- Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
- Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
- Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
- Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
- Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
- Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
- Cheng, W. -. Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
- Cheng, W. -. Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
- Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
- Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
- Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
- Hou, J. -. T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
- Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
- Cheng, W. -. Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
- Wages, P. A., Cheng, W. -. Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).
