JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Recherche en cancérologie

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

Published: February 07, 2018
doi:
10.3791/56945
, ,
1Department of Environmental Sciences and Engineering, Gillings School of Global Public Health,University of North Carolina at Chapel Hill, 2Environmental Public Health Division,National Health and Environmental Effects Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education

Summary

Bu el yazması oksidatif stres xenobiotic kaynaklı incelenmesi için genetik olarak kodlanmış fluorogenic gazetecilere canlı hücre görüntüleme bir uygulamada kullanımını açıklar. Bu deneysel yaklaşım eşsiz kronolojik zamanmekansal çözünürlük, duyarlılık ve özgüllük eksiklikleri toksikolojik oksidatif stres tespiti için kullanılan geleneksel yöntemlerden birçoğu kaçınırken sunmaktadır.

Abstract

Oksidatif stres sık atıf toksikolojik mekanizması olmakla birlikte, eksiklikleri, örnek, potansiyel eserler getirilmesi ve özgüllük reaktif için eksikliği de dahil olmak üzere bir dizi üzerinde çalışmak için geleneksel yöntemler muzdarip türler dahil. Böylece, gözlemlemek ve hücre içi Redoks tedirginlikler, daha yaygın olarak anılacaktır oksidatif stresi ölçmek için kullanılan non-yıkıcı, hassas ve belirli yöntemleri için toksikoloji alanında geçerli bir ihtiyaç vardır. Burada, iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri, roGFP2 ve HyPer canlı hücre görüntüleme çalışmaları xenobiotic kaynaklı oksidatif yanıt-e doğru gözlemek için kullanılmak üzere, kullanımlar için bir yöntem mevcut. roGFP2 Sakinleştiği glutatyon Redoks ile potansiyel (EGSH), HyPer doğrudan hidrojen peroksit (H2O2) algılar. Her iki sensörleri çeşitli hücre tiplerinin transfection veya iletim yoluyla içine ifade ve belirli hücresel kompartmanlarda hedeflenebilir. En önemlisi, bu sensörler kullanarak live-cep mikroskobu geleneksel yöntemlerle mümkün değildir yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük sunar. Floresan yoğunluğu göstergesi için sırayla 404 tarafından heyecanlı zaman her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörler olarak 510 nm hizmet izlenen değişiklikleri nm ve 488 nm ışık. Bu özellik her iki sensörler ratiometric, ortak mikroskobu eserler ortadan kaldırmak ve sensör ifade hücreleri arasındaki farklılıkları için düzeltme yapar. Bu metodoloji Fluorometrik platformlarda confocal görüntüleme sistemleri, geleneksel geniş alanlı mikroskobu ve plaka ile kullanıma uygun yapım o reçete dalga boylarında, heyecan verici ve toplama emisyonlarının yetenekli genelinde uygulanabilir okuyucular. Her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri hücre tipleri ve toksikolojik çalışmalar çeşitli hücresel EGSH ve H2O2 nesil gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılır. Burada özetlenen Fluorometrik platformları için roGFP2 ve HyPer uygulama live-hücre toksikolojik Değerlendirmeler oksidatif stres ve hücre tipleri arasında yaygın olarak uyarlanabilir standart bir yöntemdir.

Introduction

“Oksidatif stres” sık sık toksikoloji, bir mekanizma olarak gösterildi henüz nadiren terimdir bu terimi özellikle açıklanmıştır. Oksidatif stres Reaktif oksijen türleri, antioksidan moleküllerin oksidasyonu serbest radikallerin neden olduğu hasar nesil de dahil olmak üzere birkaç hücre içi işlemler için başvuruda bulunabilir ve belirli sinyal bile aktif basamaklandırır. Oksidatif stres ya da doğrudan eylem tarafından xenobiotic tesisin5 ikna etmek için belgelenen çevre kirletici1,2 ve ilaç ajanlar3,4 geniş bir yelpazesi ,6 veya ikincil olarak hücresel yanıt7,8,9,10parçası olarak oksidan türlerin üretimi. Bu nedenle doğru gözlemlemek ve olumsuz sonuçlara yol önde gelen oksidatif süreçleri karakterize toksikoloji büyük ilgi. Oksidatif stres ölçme geleneksel yöntemlerle oksitlenmiş biomolecules11,12,13,14,15 veya antioksidan16 kimliği içerir ,17,18,19,20veya reaktif türler kendilerini21,22,23, doğrudan ölçümü 24. Ancak, bu yöntemler genellikle kez örnek tüketir, Uzaysal çözünürlük ortadan kaldırır ve potansiyel olarak eserler25tanıştırmak hücresel bozulma, gerektirir. Oksidan türler tespiti ve oksidatif stres işaretleri için daha hassas ve belirli yöntem geliştirme genel olarak xenobiotic maruz kalma yan etkilerinin incelenmesi için geçerlidir.

Yeni nesil fluorogenic genetik olarak kodlanmış sensörleri kullanarak live-cep mikroskobu canlı hücreler hücre içi Redoks durumunun izlenmesi için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu sensörler genellikle bir vektör transfection veya iletim yöntemleri ile tanıtılan bir viral organizatörü kontrol altında kullanarak ifade edilir. Floresan sensör ifade hücreleri kolayca görsel olarak tanımlanabilir beri yüksek ifade verimliliği gerekli değildir. Toksikolojik değerlendirmeler için gerçek zamanlı olarak xenobiotic bileşikler maruz Floresans mikroskobu kullanılarak bu sensörler ifade hücreleri görülebilir. Bu deneysel tasarım aynı hücrede tekrarlanan ölçümler her hücrenin kurulan temel kendi kontrolü hareket etmeye izin verir. Canlı hücre görüntüleme tarafından tanınan yüksek zamansal çözünürlük oksidatif olaylar, özellikle de mütevazı büyüklüğü veya geçici doğada algılanması için çok uygundur. Hassas ve belirli hedef molekülleri olmasının yanı sıra, bazı bu sensörler Floresans iki dalga boylarında ışık kullanarak heyecanlı. Bu olay bu sensör ifade, hücre kalınlığı, lamba değişimleri gibi eserler nedeniyle gelen otantik sensör yanıtları ile ilişkili sinyal değişiklikleri muhakeme izin veren bir oranı olarak ifade edilecek floresan emisyon izin verir. yoğunluğu, photobleaching ve duyarlılık Floresans dedektörü26. Fluorogenic sensörleri kullanımı bir diğer avantajı onlar için geleneksel yöntemler25,26,27tarafından eşsizdir Uzaysal çözünürlük düzeyi oluşturulmasını belirli hücresel kompartmanlarda yönlendirilebilir değil.

Yeşil flüoresan protein (GFP) göre genetik olarak kodlanmış sensörler büyük bir ailenin geliştirilmiş ve fizyolojik işaretleri, pH, sıcaklık, kalsiyum konsantrasyonu ve ATP/ADP oranı25 de dahil olmak üzere geniş bir çeşitlilik üzerindeki raporunda karakterize ,28,29,30,31. Bunlar arasında glutatyon Redoks potansiyeli (EGSH) ve hidrojen peroksit (H2O2) sensörler bulunmaktadır. Bu sensörler Redoks Biyoloji ve Tıp uygulamaları için geliştirilen iken, onlar da oksidatif stres xenobiotic kaynaklı çalışmaya adapte olmuştur. Özellikle, burada özetlenen Protokolü EGSH sensör roGFP2 ve H2O2 sensör HyPer kullanımını açıklar.

roGFP2 hücre içi azaltılmış ve okside glutatyon (GSH/GSSG) glutatyon peroksidaz (GPx), glutaredoxin (Grx) ve glutatyon redüktaz ilgili bir Redoks röle aracılığıyla Redoks potansiyeli (GR) (Resim 1)25, raporlar 32 , 33. glutatyon baskın hücresel antioksidan moleküldür ve öncelikle haliyle azaltılmış (GSH) sitozol25,34millimolar konsantrasyonlarda bulunur. EGSH işlev herhangi bir sonuca bağlı olmayan ise, hücre içi oksidatif durumu34önemli bir göstergesi olarak kabul edilmektedir. GSSG konsantrasyonu nispeten küçük bir artış roGFP2 tarafından tespit EGSH artış sonuçlanır. Aynı derecede önemli, EGSH izleme xenobiotic pozlama sırasında roGFP2 kullanarak potansiyel olarak çok Redoks röle birkaç noktada etki mekanizması hakkında ortaya çıkarabilir ve Pentoz fosfat gibi ilişkili yollar (Resim 1 şönt )35. Burada tartışılan ikinci sensör, HyPer, bu sarı floresan protein (YFP) ekleme bakteriyel H2O2düzenleyici etki alanına türetilmiş hücre içi bir H2O2 sonda-hassas transkripsiyon OxyR136faktör. Her ne kadar bu daha önce zarar verici bir Reaktif oksijen ara olarak kabul edilmiştir, H2O2 giderek önemli bir hücre içi sinyal molekülü fizyolojik şartlarda37, altında olarak tanınır H2O2 için tanınmayan rolleri toksikoloji de bulunduğunu öne 38. Örneğin, aşırı H2O2 xenobiotic bir poz tarafından indüklenen hücresel sinyal veya bioenergetics bir kayma bozukluk habercisi olabilir.

Her iki genetik olarak kodlanmış fluorogenic sensörleri insan epidermoid Karsinomu hücre kültürünü A431 ve BEAS-2B EGSH ve H2 değişiklikleri gözlemlemek için insan bronş epitel hücre satırı da dahil olmak üzere birçok kurulan hücre hatlarında ifade edilmiştir O2 toksikolojik Etkilenmeler çeşitli yanıt olarak. Bunlar gaz halinde olan yakıtlar kirleticiler (ozon35), Partiküler madde (1,2 naphthoquinone39,40 ve çinko41) ve nikel nano tanecikleri (yayınlanmamış veri) çözünür bileşenler içerir. Bu çalışmalar bu iki sensörler olası uygulamaları yalnızca küçük bir bölümünün temsil eder. Teorik olarak, alma ve DNA’sı bu sensörler geleneksel moleküler biyoloji teknikleri ile ifade etme özelliği olan herhangi bir hücre tipi hücresel oksidatif durumu değiştirmek için şüpheli xenobiotics etkilerini değerlendirmek için yararlı olabilir. Bugüne kadar bir veya daha fazla bu sensörlerin ifade çeşitli prokaryot ve Ökaryotlar, dahil birçok memeli, bitki, bakteri ve Maya hücre türleri25,26,36,42edilmiştir. Göstergesi EGSH ve H2O2 sensörleri için 510 yayılan floresan yoğunluğu bir değişimdir nm uyarma ile 488 ve 404 nm ışık üzerine. Bu yöntem mikroskobu (confocal ve geniş alanlı) ve plaka okuyucu türleri dahil olmak üzere Fluorometrik platformda yaygın olarak adapte olur. Burada sunulan yöntemi duyarlı ve spesifik hücre içi EGSH ve H2müşahede vitro toksikolojik sistemlerinde O2 sağlar.

Protocol

1. hücre hazırlanması Not: Bu yordam bir ölümsüzleştirdi hücre hattı (BEAS-2B; lentiviral iletim açıklar. İstenen muhabir (roGFP2 veya HyPer) ifade etmek için ATCC, Manassas, VA). Onlar gazeteci ifade görüş alanı (genellikle 5-10 hücreleri) başına sensör ifade hücreleri yeterli sayıda görselleştirmek yeterli bir düzeyde neden olduğu sürece diğer hücre hatları/tipleri ve/veya gen transferi, transfection, dahil yöntemleri kullanılabilir. Eğer transfection yönteml…

Representative Results

İçinde değişiklikleri EGSH ve hücre içi H2O2 ‘ hafiye roGFP2 ve HyPer kullanımı iyi olmuştur25,36,42,43 daha önce açıklanan ve burada gösterilmiştir. Confocal görüntüleri roGFP2 temel ve H2O2 ve DTT aşağıdaki ek ifade hücre Şekil 2’ de gösterilmiştir. Ver…

Discussion

İçinde hafiye değişiklikler hücre içi EGSH ve H2O2, sırasıyla, roGFP2 ve HyPer kullanımı önceki fizyolojik ve toksikolojik çalışmalar 25,35,36 iyi tarif olmuştur ,39,40,41,42,43. Burada özetlenen Protokolü …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar deneysel tasarım ve el yazması düzenlemeleri konusunda yardım almak için Katelyn Lavrich teşekkür etmek istiyorum.

Materials

roGFP2 Plasmid University of Oregon N/A Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid Evrogen FP941
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009
Dithiothreitol Sigma Aldrich 10708984001
9,10-Phenanthrenequinone Sigma Aldrich 156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes Ted Pella 14029-20
BEAS-2B cell line American Type Culture Collection CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium Lonza 192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Excel  Microsoft Office Suite N/A
NIS-Elements AR Imaging Software Nikon N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System Nikon N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
  2. Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
  3. Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
  4. Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
  5. Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
  6. Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
  7. Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
  8. Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
  9. Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
  10. Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
  11. Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P. Gel-based methods in redox proteomics. Biochim Biophys Acta. 1840, 830-837 (2014).
  12. Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user’s perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
  13. Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
  14. Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
  15. Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
  16. Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
  17. Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
  18. Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
  19. Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
  20. Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
  21. Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
  22. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
  23. Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
  24. Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
  25. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxid Redox Signal. 13, 621-650 (2010).
  26. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
  27. Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
  28. Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
  29. Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
  30. Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
  31. Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
  32. Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
  33. Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
  34. Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
  35. Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
  36. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
  37. Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
  38. Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
  39. Cheng, W. -. Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
  40. Cheng, W. -. Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
  41. Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
  42. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
  43. Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
  44. Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
  45. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
  46. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
  47. Hou, J. -. T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
  48. Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
  49. Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
  50. Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
  51. Cheng, W. -. Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
  52. Wages, P. A., Cheng, W. -. Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).

Tags

Genetically-encoded Fluorogenic SensorsToxicological Oxidative StressRedox HomeostasisConfocal MicroscopyEnvironmental ControlsReal-time AcquisitionStage-top Environmental ChamberNumerical ApertureWide-field Fluorescence Illumination

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Corteselli, E. M., Samet, J. M., Gibbs-Flournoy, E. A. Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors. J. Vis. Exp. (132), e56945, doi:10.3791/56945 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image