Detta manuskript beskriver användningen av transgena reporter möss och olika administreringsvägar av fluorescerande färger i angiotensin II-inducerad hypertoni med intravital video mikroskopi av blodkärl för att utvärdera aktivering av immunceller och deras förmåga att rulla och följa endotelet.
Epifluorescence intravital video mikroskopi (IVM) av blodkärl är en etablerad metod att utvärdera aktivering av immunceller och deras förmåga att roll och följa det endothelial lagret. Visualisering av cirkulerande celler genom injektion av fluorescerande färgämnen eller fluorophore-kopplade antikroppar används ofta. Alternativt, fluorescerande reporter möss kan användas. Interaktioner av leukocyter, i synnerhet lysozym M+ (LysM+) monocyter, med kärlväggen spelar avgörande roller i främjandet av vaskulär dysfunktion och arteriell hypertension. Här presenterar vi tekniken för att visualisera och kvantifiera leukocyt rullande och vidhäftning i halspulsåder i angiotensin II (AngII)-inducerad hypertoni hos möss av IVM.
Implantation av en kateter skadar kärlväggen och leder till förändrad blodkroppar svaren. Vi jämförde olika injektionsteknik och administreringsvägar att visualisera leukocyter i ett LysMCre+IRG+ mus med utbredd uttryck av röd fluorescerande protein och villkorsuttryck av grönt fluorescerande protein i LysM + celler. För att studera LysM+ cellaktivering, vi använde AngII infunderas möss där rullande och vidhäftning av leukocyter till endotelet ökas. Vi injiceras antingen akridin orange med en jugular kateter eller direkt om svansen ven och jämförde mängden rullande och följa celler. Vi fann att jugular katetern implantation i sig ökade antalet rullande och vidhängande LysM+ celler i sham-infunderas LysMCre+IRG+ möss jämfört med kontroller. Denna aktivering utökades i AngII-infunderas möss. Intressant, injicera akridin orange direkt genom svansen ven inte ökade LysM+ celladhesion eller rullande i sham-infunderas möss. Vi har därmed visat vikten av transgena reporter möss uttrycker fluorescerande proteiner för att inte störa i vivo processer under experiment. Dessutom kan svans ven injektion av fluorescerande spårämnen vara ett möjligt alternativ till jugular katetern injektioner.
Högt blodtryck ökar risken för kardiovaskulär sjukdom och död och främjar utvecklingen av ateroskleros, kranskärlssjukdom och arteriell eller venös thromboembolisms1. Utvecklingen av hypertoni är beroende av samspelet mellan miljö, genetiska, endokrina och hemodynamiska faktorer. För närvarande uppskattas immunitet och relaterade inflammation för att spela en viktig roll i etiologi av hypertoni2.
Bland immuna celler befanns T-lymfocyter och monocyter samt makrofager vara kausalt inblandade i AngII-inducerad vaskulär inflammation och hypertoni, delvis relaterade till deras förmåga att utlösa reaktivt syre arter3. Makrofag granulocytkolonistimulerande faktor bristfällig möss uppvisade nedsatt svar på AngII angående blodtryck ökar och vaskulär inflammation4. I ett tidigare arbete, kunde vi visa att LysM + monocyter driva vaskulär dysfunktion och inflammation i AngII-inducerad hypertoni5. Mer nyligen, beskrev vi en ny väg i vilken koagulering faktor XI samarbetar med trombocyter och kärlväggen att inducera trombin-beroende vaskulär inflammation6. Den nuvarande kunskapen om rollen av immunförsvaret vid hypertoni var nyligen sammanfattas och granskats av Rodriguez-Iturbe et al. 7
Eftersom medverkan av immunceller i utvecklingen av hypertoni blev uppenbart, blev modeller och tekniker för att studera interaktionen mellan fartyget och immunceller nödvändigt. Epifluorescence IVM av blodkärl är ett användbart verktyg att iaktta i vivo interaktioner mellan cirkulerande blodkroppar och endotel8,9,10. Med denna teknik, kan injektion av färgämnen infoga med DNA (som akridin orange) visualisera kärnförsedda celler (cirkulerande liksom från endotelet). Isolerade blodplättar färgas ex vivo med rhodamin – 6 G eller dichlorofluorescein (DCF) kan injiceras för att visualisera trombocyt-rika trombos i arteriell eller venös skada modeller.
Vanligtvis en halsvenen kateter används att injicera spårämnen eller markerade trombocyter. Ändring av endotel och efterföljande aktivering av koagulationskaskaden är båda kända för att ha effekter på monocyt aktivering. Endoteliala skador leder omedelbart till trombocytaktivering via subendothelial matrix molekyler att täta vävnad, med efterföljande monocyt attraktion och aktivering11. Tvärtom, är en intakt endotel kända för att ha blodförtunnande egenskaper (t.ex. via vävnad factor pathway inhibitor eller thrombomodulin)12 och direkt hämmande effekter på monocyt, t.ex., genom utsöndring av extracellulära blåsor som innehåller mikroRNA13. Monocyter är kända för att producera en vävnadsfaktor, extrinsic aktivator av koagulationskaskaden och express proteas-aktiverat (PARs) receptorer som kan aktiveras av trombin och delta i monocyt aktiveringen14,15 . Därför, någon aktiveringen av trombocyter eller koagulationskaskaden på grund av vaskulär skada kan ha oväntade effekter på monocyt aktivering och störa det observerade fenomenet. Med hjälp av IRG transgena LysM Cre transgena möss, en dubbel-fluorescerande Cre reporter mus (LysMCre+IRG+) föreslår vi att i detalj studera effekten av injektioner med en kateter och alternativa metoder på LysM+ myelomonocytär celler i en musmodell av arteriell hypertension16.
LysM+ monocyter har tidigare visat sig vara inblandade i utvecklingen av hypertoni5. Här visar vi att LysM+ immunceller rulla och följer det endothelial lagret svar på AngII infusion. Detta konstaterande erhölls med LysMCre+IRG+ möss från våra tidigare studier för att undersöka rollen av immunceller i hypertoni i vivo genom att visualisera leukocyter med injektion av akridin orange6,10. Diskriminering av celltyper som ansluter sig till endotelet var alltså inte möjligt.
IVM är ett mycket användbart verktyg för vaskulär studier och i vivo observationer av celler direkt i kärlsystemet, men effekterna av injicera färgämnen med hjälp av en kirurgiskt insatt kateter i inflammatoriska samband med hypertoni förblir okänd. Att utvärdera den potentiella effekten av katetern och akridin orange injektion tog vi fördel av LysMCre+IRG+ möss. AngII infusion ökade numrera av rullande LysM+ celler till endotelet. Införande av en kateter i halsvenen förstärks effekten och mer rullande och vidhängande leukocyter upptäcktes i AngII-infunderas möss instrumenterad med en kateter som jämfört med möss utan kateter implantat. Detta indikerar att implantation av en halspulsådern katetern orsakar en systemisk inflammatorisk reaktion i samband med sårläkning som läggs med en immunreaktion som sett i hypertoni18. Dessutom, på grund av närheten av halsvenen till halspulsådern kan en ytterligare immunsystemets aktivering ha inträffat genom att påverka halsvenen. Eftersom denna effekt inte var närvarande när injektioner direkt i svansen ven, vi kan anta att effekten berodde inte färgen utan att förfarandet för att föra in katetern. Vi visade här vikten av transgena reporter möss uttrycker fluorescerande proteiner för att inte störa i vivo processer under experiment. Dessutom kan svans ven injektion av fluorescerande spårämnen vara ett möjligt alternativ till jugular katetern injektioner.
Ett kritiskt steg av förfarandet är AngII infusionen. Svans manschetten bedömning av blodtryck kan göras för att kontrollera effektiviteten av AngII leveransen av pumpen. Blodtrycket bör öka efter 2−3 dagar efter infusion. För att begränsa inflammation som skulle kunna påverka LysM+ celler aktivering, bör stängning av snittet där pumpen implanteras göras med suturer istället för klipp. En begränsning måste noteras om svansen ven injektion: för att göra bästa möjliga dataförvärv, 4 videoklipp tas normalt för varje halspulsådern. Om fluorescerande signalen minskar, 50 µL akridin orange injiceras men med svans injektion är det svårare att göra flera injektioner och hålla halspulsådern stabil under målet mikroskopet. Varaktigheten av närvaron av en kateter i halsvenen kan dessutom differentiera dessa immunceller aktiveringen eftersom den påverkar koagulering aktiveringen i trombocyt-rich plasma förberett 4 h efter katetern implantation19. Denna aspekt av katetern implantation behöver ytterligare utredning.
Slutligen, även om vi uppskattar effekterna av jugular katetern implantation på LysM+ cellaktivering efter AngII infusion, inte kan vi fullt uppskatta rollen av förberedelse, hud borttagning och halspulsådern isolering på en potentiell LysM+ -cell aktivering. Vi konstatera att användningen av fluorescens reporter möss gillar LysMCre+IRG+ mus rekommenderas att undvika störningar av fartygets integritet under djurens förberedelserna för i vivo imaging.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av det tyska ministeriet för utbildning och forskning (BMBF 01EO1003 och BMBF 01EO1503).
Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
Braunol | B Braun | ||
Octeniderm | Schülke | ||
Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS – DualView2 MicroImager | |
Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |