Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para aumentar a produção da Quimera sem o uso de novos equipamentos. Uma mudança de orientação simples do embrião para injeção pode aumentar o número de embriões produzidos e potencialmente reduzir a linha do tempo de transmissão da linha germinal.
Abstract
Em um esforço para aumentar a eficiência na criação de ratos geneticamente modificados através de metodologias de célula ES, apresentamos uma adaptação para o atual protocolo de injeção de blastocisto. Aqui nós relatamos que uma simples rotação do embrião e injeção através de massa celular de Trans-interior (TICM) aumentou a porcentagem de ratos quiméricoes de 31% para 50%, sem nenhum equipamento adicional ou formação mais especializada. e mais uns 26 diferentes clones, e 35 totais clones foram injetados ao longo de um período de 9 meses. Não houve nenhuma diferença significativa entre as técnicas tradicionais de injeção e TICM na taxa de gravidez ou taxa de recuperação de embriões. Portanto, sem qualquer alteração importante no processo de injeção e um simples posicionamento do blastocisto e injetando através do ICM, liberando as células ES na cavidade blastocoel pode potencialmente aumentar a quantidade de produção quimérico e subsequente transmissão da linha germinal.
Introduction
Por quase 25 anos, a criação de camundongos geneticamente alvo tem sido um processo lento, muitas vezes prejudicado por um gargalo na fase de microinjeção de blastocistos ES celular para a geração de germline transmitindo quimeras. Recentes avanços, incluindo CRISPR/Cas91,2 direcionamento em pilhas do ES e elevado-throughput ES celulares consórcios de geração como KOMP, melhoraram a geração/disponibilidade de células ES geneticamente modificadas. No entanto, a geração de quimeras germline continua a ser um gargalo na criação de ratos geneticamente modificados destas células de ES3,4. Projetos de geração de célula do elevado-throughput ES tem sido atormentados por alta variabilidade na qualidade de célula ES, que é fundamental para a criação bem sucedida do germline quimeras. Além disso, algumas das linhas celulares ES comumente utilizadas são conhecidas por aneuploidia alta e difícil produção do germline quimeras competente5.
Muitos métodos têm sido desenvolvidos para a criação de ratos com uma quimera ou superior, ou completamente ES células derivadas ratos6,7,8,9,10. Enquanto cada um desses sistemas tem seus próprios méritos, eles também têm suas falhas. A geração de quimeras tetraploide, enquanto gerar células de ES 100% derivado de ratos, é ineficiente e geralmente limitado a linhas outbred 5,6. Novos métodos de injeção de mórula podem gerar alta porcentagem de quimeras, quase 100%, mas geralmente requerem equipamento adicional significativo (lasers ou piezos) e formação de10,11. Nos laboratórios onde estas técnicas já estão em vigor, esta nova metodologia pode não ser necessária.
O objetivo do presente estudo foi encontrar um método que usa técnicas comuns e equipamentos disponíveis para aumentar a taxa de geração de Quimera, aumentando a chance de transmissão do germline do alelo mutante para estabelecer a colônia de rato subsequentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isso tem sido pensado que qualquer perturbação do ICM pode levar à mortalidade, na verdade, protocolos atuais de microinjeção de blastocisto ainda alertam para este12,13. O que mostramos aqui é que microinjeção através do ICM não é prejudicial para o embrião e aumenta o rendimento de quimeras.
O mecanismo exato para este efeito não foi identificado. No entanto, a ruptura mecânica do ICM, e o hipoblasto que acompanha, deve…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada [em parte] pelo programa de pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional de Ciências de saúde ambiental. Agradecimento especial a Shyamal Peddada para análise estatística. Gostaríamos também de agradecer Humphrey Yao, Gary Bird e Yuki Arao para revisão deste manuscrito, e Franco DeMayo por seu contínuo apoio e conselhos.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
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