इस प्रोटोकॉल मानव आंत्र organoids में औषधीय उपचार के बाद फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और लाइव सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर वास्तविक समय में उपकला बाधा पारगम्यता की माप का वर्णन करता है.
बायोप्सी के माध्यम से प्राप्त या pluripotent स्टेम सेल द्वारा निर्देशित विभेद के माध्यम से उत्पन्न आंतों के ऊतकों की 3 डी संस्कृति में अग्रिम, आंत्र म्यूकोसा के इन विट्रो मॉडल में परिष्कृत में हुई है । इन उभरते मॉडल प्रणालियों का लाभ उपकरण और 2 डी संस्कृति प्रणालियों और जानवरों के लिए विकसित तकनीकों के अनुकूलन की आवश्यकता होगी । यहाँ, हम वास्तविक समय में मानव आंत्र organoids में उपकला बाधा पारगम्यता को मापने के लिए एक तकनीक का वर्णन. यह epifluorescent फिल्टर के साथ लगे एक औंधा माइक्रोस्कोप पर फ्लोरोसेंट-लेबल dextran और इमेजिंग के microinjection द्वारा पूरा किया जाता है । आंत्र organoids में बाधा पारगम्यता के वास्तविक समय मापन मानव आंत्र उपकला ऊतक में उच्च संकल्प लौकिक डेटा की पीढ़ी की सुविधा, हालांकि इस तकनीक को भी तय timepoint इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए लागू किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल को औषधीय एजेंटों, बैक्टीरियल उत्पादों या विषाक्त पदार्थों, या जीवित सूक्ष्मजीवों के लिए जोखिम के बाद उपकला बाधा पारगम्यता की माप के लिए आसानी से अनुकूलनीय है. मामूली संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल भी आंतों organoids के microinjection पर एक सामान्य प्राइमर के रूप में सेवा कर सकते हैं और उपयोगकर्ताओं को microinjection निम्नलिखित अतिरिक्त या वैकल्पिक बहाव अनुप्रयोगों के साथ इस प्रोटोकॉल के पूरक करने के लिए चुन सकते हैं.
आंतों उपकला एक चयनात्मक बाधा है कि पोषक तत्वों के दिशात्मक परिवहन, एच2ओ, आयनों, और अपशिष्ट उत्पादों जबकि गैर विशिष्ट प्रसार-लुमेन और के बीच अन्य कणों की मध्यस्थता विनिमय को कम करने के लिए फार्म mesenchymal ऊतक या रक्त की आपूर्ति1,2. आंत्र उपकला बाधा के विशिष्ट पारगम्यता लंबे समय दोनों स्वास्थ्य और रोग में एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक पैरामीटर माना गया है3,4,5,6, की दर को दर्शाता है कि paracellular अंतरिक्ष के माध्यम से उपकला भर में छोटे अणुओं के प्रसार. उपकला बाधा पारगम्यता का मापन पशु मॉडल7 में और मानव रोगियों में8 lactulose की घूस, जो जठरांत्र संबंधी मार्ग में कोई विशेष ट्रांसपोर्टर है के माध्यम से आयोजित किया जा सकता है, और बाद में संग्रह और परिधीय रक्त में lactulose सांद्रता का मापन. इस तरह के फ्लोरोसेंट लेबल कार्बोहाइड्रेट के रूप में बाधा समारोह के वैकल्पिक घूस मार्करों भी उपलब्ध है9,10। इस दृष्टिकोण आंत्र उपकला कोशिका Transwell पर उगाया संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया है11का समर्थन करता है, एक सरलीकृत दृष्टिकोण है कि अधिक से अधिक प्रयोगात्मक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी vivo में एक गरीब कारक के रूप में आलोचना की गई है विभेदक उपकला उपप्रकार और ऊतक संरचना के अभाव के कारण पारगम्यता12. कक्षों का उपयोग अभी तक एक और दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं और पूरे आंत्र म्यूकोसा में उपकला बाधा समारोह की माप के लिए अनुमति पूर्व vivo13. इस तकनीक के आवेदन अक्सर ऊतक उपलब्धता और हालत13,14द्वारा सीमित है । इस प्रकार नए तरीकों जो संतुलन reproducibility और शारीरिक प्रासंगिकता के साथ प्रवाह आवश्यक हैं ।
इन विट्रो organogenesis में हाल की घटनाओं में 3 डी ऊतक संस्कृति के गोद लेने के लिए नेतृत्व किया है recapitulating जटिल ऊतकों की गतिशीलता के लिए एक परिष्कृत मंच के रूप में मॉडल सिस्टम15,16,17 ,18,19,20,21,22,23। विशेष रूप से, मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) व्युत्पन्न मानव आंत्र organoids (HIOs)19,24 मेजबान के अध्ययन के लिए एक प्रतिलिपि और प्रयोग करने योग्य मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है माइक्रोबियल बातचीत और उपकला बैरियर गतिशीलता25,26,27,28. इसी प्रकार, मानव ऊतक-व्युत्पंन organoids (enteroids के रूप में भी जाना जाता है) एक सरल बायोप्सी प्रक्रिया से व्युत्पंन किया जा सकता है और मानव शरीर क्रिया विज्ञान और रोग15,29,30का अध्ययन करने के लिए एक तंत्र के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । Microinjection मानव आंत्र organoids प्रायोगिक यौगिकों के वितरण के लिए अनुमति देता है25 या जीवित रोगाणुओं25,31,३२,३३ शिखर उपकला के लिए organoid लुमेन की सतह । Leslie और हुआंग एट अल. 25 हाल ही में इस तकनीक को अनुकूलित करने के लिए fluorescein isothiocyanate (FITC) के साथ HIOs microinjected में बाधा पारगम्यता को मापने जीवाणु विषाक्त पदार्थों को dextran के बाद प्रदर्शन लेबल ।
इस प्रोटोकॉल hPSC में उपकला बाधा पारगम्यता की माप के लिए एक गाइड के रूप में करना है-व्युत्पन्न HIOs और ऊतक-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर HIOs व्युत्पंन. मामूली संशोधनों के साथ, यह भी प्रयोगात्मक यौगिकों के साथ HIOs के microinjection पर एक सामान्य प्राइमर के रूप में सेवा कर सकते हैं. उपयोगकर्ताओं को microinjection के बाद अतिरिक्त या वैकल्पिक बहाव अनुप्रयोगों के साथ इस प्रोटोकॉल के पूरक हो सकता है ।
इस प्रोटोकॉल hPSC-व्युत्पंन HIOs और ऊतक व्युत्पंन आंत्र organoids और वास्तविक समय में उपकला बाधा पारगम्यता की माप के microinjection के लिए एक सामान्य प्रयोजन विधि स्थापित करता है । हम भी विश्लेषण और इन तरीकों का उपयोग कर उत्पंन डेटा की व्याख्या करने के लिए हमारे दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया है । आंतों organoids मॉडल सिस्टम की बढ़ती गोद16,20,21,28 और एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक कार्यात्मक के रूप में आंतों बाधा पारगम्यता में लंबे समय से ब्याज को देखते हुए परिणाम3,4,5,6, हमें आशा है कि इस क्षेत्र में काम कर रहे दूसरों को लागू करने और इन तरीकों पर निर्माण करने में सक्षम हो जाएगा ।
कई कदम है जो इस तकनीक के आवेदन के लिए महत्वपूर्ण हैं । उच्च गुणवत्ता hPSC-या ऊतक व्युत्पंन हीयो ऊतक microinjection के साथ व्यापक प्रयोग करने से पहले स्थापित किया जाना चाहिए करने के लिए उपयोग । हीयो macrostructure हो सकता है heterogenous, दोनों आकार और आकार में भिन्नता के साथ, हालांकि ऊतक पहचान और सेलुलर आकृति विज्ञान अत्यधिक प्रतिलिपि है जब स्थापित पद्धति का उपयोग करने के लिए HIOs24उत्पन्न. गोलाकार HIOs एक एकल अर्द्ध पारदर्शी लुमेन से मिलकर और लगभग माप 1 मिमी व्यास में microinjection और वास्तविक समय में चमकदार प्रतिदीप्ति की माप के लिए आदर्श होते हैं । कुछ मामलों में, microinjection, हीयो या इंजेक्शन सामग्री के स्पष्ट रिसाव के पतन में जिसके परिणामस्वरूप विफल हो जाएगा । विफल HIOs एक मानक micropipette का उपयोग कर उपयोगकर्ता के विवेक पर अच्छी तरह से संस्कृति से हटाया जा सकता है । microinjection और इमेजिंग के लिए HIOs का चयन करते समय एक इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर उपलब्ध उद्देश्य लेंस पर विचार करें । सामांय में, 2 4x उद्देश्य लेंस पूरा हीयो फ्लोरोसेंट संकेत पर कब्जा करने के लिए आदर्श होते हैं, हालांकि एक 10x उद्देश्य इस्तेमाल किया जा सकता है अगर कम पावर लेंस उपलब्ध नहीं है या यदि उपलब्ध HIOs & #60; व्यास में 1 मिमी । इमेजिंग सॉफ्टवेयर समय के साथ परिभाषित बिंदुओं पर फ्लोरोसेंट छवियों के स्वचालित कब्जा के लिए अनुमति चाहिए ।
इस प्रोटोकॉल के कई संशोधनों के क्रम में प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप संभव हो रहे हैं । उदाहरण के लिए, बैरियर समारोह परीक्षणों के परिणामों का उपयोग४३ में यौगिकों के आणविक आकार पर निर्भर हो सकता है और यह आणविक वजन बदलती की dextran तैयारियों का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त हो सकता है । इसके अलावा, brightfield इमेजिंग ऊतक के समग्र संरचनात्मक अखंडता के एक संकेतक के रूप में प्रतिदीप्ति इमेजिंग के अलावा किया जा सकता है25। जब जीवित जीवाणुओं के microinjection प्रदर्शन25,28,31,३२,३३,४४, यह पेनिसिलिन जोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है और streptomycin या gentamicin करने से पहले या बाद में हीयो कल्चर मीडिया को microinjection । microcapillary के बाहर बैक्टीरियल संस्कृति निलंबन के साथ भरने के दौरान दूषित हो जाएगा और यह हीयो मीडिया को हस्तांतरित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, microinjection मीडिया के बिना extracellular मैट्रिक्स (जैसे, Matrigel) में निलंबित HIOs पर किया जा सकता है, microinjection पूरा होने के बाद मीडिया को जोड़ने । इस extracellular मैट्रिक्स और हीयो के बाहरी चेहरे को प्रदूषित सीमा हो सकती है । जब माइक्रोबियल विकास परख की योजना बना, यह 1-2 एच के बाद मीडिया में एंटीबायोटिक दवाओं को दूर करने के लिए धीमी गति से बचने या microinjected जीवों के विकास को रोकने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
अंत में, पहचानने कि नहीं सभी शोधकर्ताओं ने सूक्ष्म उपकरणों के लिए उपयोग होगा इन विट्रो इमेजिंग में करने के लिए उपयुक्त है, यह कहना महत्वपूर्ण है कि प्रतिदीप्ति डेटा इकट्ठा करने के लिए इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रक्रियाओं छवियों के लिए लागू किया जा सकता है फिक्स्ड timepoints पर स्वचालित छवि पर कब्जा या पर्यावरण नियंत्रण के बिना मानक epifluorescent माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । इस दृष्टिकोण के उदाहरण Leslie और हुआंग एट अल द्वारा रिपोर्टों में पाया जा सकता है । 25, जो hPSC-व्युत्पन्न आंत्र organoids में सी. डिफीसाइल विष गतिविधि की जांच की, और कर्वे और Pradan एट अल. ४४, जो इसी तरह hPSC में उपकला बाधा पारगम्यता की जांच की-लाइव ई. कोलाईके साथ आंत्र organoids microinjected व्युत्पंन । इमेजिंग उपकरण के मैनुअल आपरेशन अधिक भिंनता में परिणाम और फ्लोरोसेंट संकेत सामांय में कठिनाई हो सकती है । जब FITC के मैनुअल इमेजिंग प्रदर्शन-dextran इंजेक्शन HIOs यह निश्चित आवर्धन, फ्लोरोसेंट उत्तेजना तीव्रता बनाए रखने के लिए आवश्यक है, और प्रयोग भर में जोखिम बार फ्लोरोसेंट तीव्रता माप बदरंग से बचने के लिए ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक डीआरएस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । स्टेफ़नी Spohn और बेसल Abuaita पर कई उपयोगी चर्चा के लिए organoid microinjection. JRS आंत्र स्टेम सेल कंसोर्टियम (U01DK103141), मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों के राष्ट्रीय संस्थान (NIDDK) और एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID) द्वारा वित्त पोषित एक सहयोगी अनुसंधान परियोजना द्वारा समर्थित है । JRS और VBY NIAID उपंयास, दर्ज रोगों (NAMSED) कंसोर्टियम (U19AI116482) के लिए वैकल्पिक मॉडल प्रणालियों द्वारा समर्थित हैं । DRH एलर्जी और संक्रामक रोग के राष्ट्रीय संस्थान से माइक्रोबियल रोगजनन प्रशिक्षण अनुदान के तंत्र का समर्थन किया है (NIAID, T32AI007528) और नैदानिक और स्वास्थ्य के लिए मिशिगन संस्थान को नैदानिक और शोधों विज्ञान पुरस्कार रिसर्च (UL1TR000433) ।
इस पांडुलिपि में उपयोग किया गया पूरा डेटा फ़ाइलें और डेटा विश्लेषण कोड https://github.com/hilldr/HIO_microinjection पर उपलब्ध हैं ।
EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) | Bioworld | 405200081 | |
Cell matrix solution (Matrigel) | Corning | 354230 | |
Deltavision RT live cell imaging system | GE Life Sciences | 29065728 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/ |
Camera | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
softWoRx Imaging software | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
Biosafety cabinet | Labconco | Cell Logic+ | http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262 |
1X PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Advanced DMEM-F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
B27 supplement (50X) | Life Technologies | 17504044 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
L-glutamine (100X) | Life Technologies | 25030-081 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
HEPES buffer | Life Technologies | 15630080 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
Manipulator | Narshge | UM-3C | |
Micromanipulator | Narshge | UM-1PF | |
Pipette Holder | Narshge | UP-1 | Alternate to Xenoworks pipette holder |
Magnetic stand | Narshge | GJ-1 | |
Dissecting scope | Olympus | SX61 | Recommended scope, although other models are likely compatible |
Olympus IX71 Fluorescent microscope | Olympus | IX71 | Included with Deltavision system |
CoolSNAP HQ2 | Photometrics | 29065728 | Included with Deltavision system |
Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein | R&D Systems | 8619-GT-020 | |
EGF | R&D Systems | 236-EG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
R-spondin 1 | R&D Systems | 4645-RS | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
FITC-dextran (4 kDa) | Sigma-Aldrich | 46944 | |
Micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | |
Nunc Lab-Tek II Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | 154526PK | |
Glass filaments | WPI | TW100F-4 | |
Micropipette holder | Xenoworks | BR-MH2 | Preferred device |
Analog Tubing kit | Xenoworks | BR-AT | |
1/16 in clear ferrule | Xenoworks | V001104 | |
1-1.2 mm O-ring | Xenoworks | V300450 |