Nous présentons ici la méthodologie pour l’analyse clonale de cellules souches hématopoïétiques précurseurs au cours du développement embryonnaire murin. Nous combinons indice tri des cellules individuelles de la région d’aorte-gonades-mésonéphros embryonnaire avec co-culture de cellules endothéliales et la transplantation pour caractériser les propriétés phénotypiques et le potentiel de prise de greffe des précurseurs hématopoïétiques unique.
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Article de méthode
Analyse clonale des précurseurs embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques à l’aide de cellule unique Index tri combinée avec Niche de cellules endothéliales co-culture
Dans cet article
Résumé
Résumé
La possibilité d’étudier la genèse des cellules souches hématopoïétiques (CSH) durant le développement embryonnaire a été limitée par la rareté des précurseurs de l’HSC dans l’embryon précoce et le manque de tests qui fonctionnellement identifier le potentiel à long terme de la prise de greffe multilignée de précurseurs HSC putatifs individuels. Nous décrivons ici la méthodologie permettant l’isolement et la caractérisation des précurseurs d’HSC fonctionnellement validés au niveau de la cellule unique. Tout d’abord, nous utilisons indice tri pour cataloguer le paramètre phénotypique précis de chaque cellule individuellement trié, en utilisant une combinaison de marqueurs phénotypiques d’enrichir des précurseurs de l’HSC avec des marqueurs supplémentaires pour l’analyse expérimentale. Deuxièmement, chaque cellule index-triées est co cultivée avec le stroma vasculaire niche de la région aorte-gonades-mésonéphros (AGA), qui prend en charge la maturation des précurseurs des HSC non-faire une exception HSC fonctionnelle avec greffe multilignée, à long terme potentiel dans essais de transplantation. Cette méthodologie permet la corrélation des propriétés phénotypiques des précurseurs hemogenic clonale avec leur potentiel fonctionnel de greffe ou d’autres propriétés telles que profil transcriptionnel, fournissant un moyen pour l’analyse détaillée des précurseurs de l’HSC développement à l’échelle de la cellule unique.
Introduction
Clonales études ont révélé une hétérogénéité dans les propriétés à long terme de greffe de CSH adultes, donnant un aperçu nouveau en sous-types HSC et changements dans le comportement HSC au cours du vieillissement1. Toutefois, des études similaires de CSH embryonnaires et de leurs précurseurs ont été plus difficile. Au début du développement embryonnaire, CSH proviennent d’une population de précurseurs connus hemogenic l’endothélium dans un processus transitoire visé à comme l’endothélium hématopoïétiques transition2. Le premier HSC, défini par leur capacité à fournir la greffe multilignée robuste, à long terme, suite à....
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) du Fred Hutchinson Cancer Research Center.
1. préparation des AGM-EC monocouches de co-culture
- 24 h avant la dissection de l’AGA et trier, faire AGA-ce milieux de culture et filtre stériliser.
- Ajouter 0,1 % de gélatine dans l’eau (100 µL/puits) dans chaque puits d’une plaque 96 puits et incuber à température ambiante pendant 15 min. aspirer les feuilles de gélatine et laisser la plaque sous une hotte de culture tissulaire avec le couvercle retiré jusqu'à ce que les puits sont à secs.
- Dissocie....
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Résultats
Figure 1 a montre une représentation schématique du plan expérimental. Une fois que les tissus P-Sp/AGM sont disséqués, mis en commun et dissociées dans collagènase, elles sont tachées avec anticorps anti-VE-cadhérine et EPCR pour le tri des index. Pre-HSC sont plus riches en cellules triées à la VE-cadhérine+EPCRélevé (Figure 1 b). Autres anticorps conjugués fluorochrome peuvent être incluses pour analyser .......
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Discussion
L’étude de la genèse de la HSC durant le développement embryonnaire nécessite des moyens pour détecter les potentiels des précurseurs hemogenic manque encore la compétence pour fournir à long terme multilignée reconstitution hématopoïétique chez les receveurs adultes transplantés HSC. Dans ce protocole, nous présentons un test clonal des hemogenic embryonnaires précurseurs par co-culture stromal sur niche vasculaire ECs de l’AGA, qui favorise la maturation des précurseurs des HSC, avec analyse fonctionnelle lors d’essais.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier Andrew Berger, Stacey Dozono et Brian Raden INSEREE dans le Fred Hutchinson Flow Cytometry d’assistance avec FACS. Ce travail a été soutenu par l’instituts nationaux de santé NHLBI UO1 grant #HL100395, auxiliaires Collaborative Grant #HL099997 et NIDDK accordent #RC2DK114777. Brandon Hadland est supporté par l’Alex Lemonade Stand Fondation et Hyundai Hope sur roues Foundation.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieux de culture AGM-EC | |||
| Matériaux pour la culture de cellules endothéliales | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Utilisation pour dissocier les monocouches AGM-EC |
| Gélatine 0,1 % dans l’eau | StemCell Technologies | 7903 | Utilisation pour faire adhérer les monocouches AGM-EC sur le plastique |
| Plaques de culture tissulaire à 96 puits | Corning | 3599 | À utiliser pour la co-culture de monocouches AGM-EC et de clones triés par index |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | pour la dissection et la coloration FACS |
| Flacons filtrants de 500 ml | Fisher Scientific | 9741202 | Utilisation pour le filtre stérile Média endothélial |
| Milieu de culture AGM-EC (500 ml) | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovin Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissous dans 10 mls de |
| milieu L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothélial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Ajouter 10 mls de milieu à dissoudre et ajouter |
| Matériaux pour l’indice AGM | |||
| Collagénase (0,25 %) | StemCell Technologies | 7902 | Utilisation pour la dissociation des tissus embryonnaires |
| Seringue de 3 ml | BD Biosciences | 309657 | Utilisation pour des solutions d’anticorps filtrants stériles pour FACS |
| 0.22 et micro ; Filtre à seringue | Millipore | SLGP033RS | Utiliser pour filtrer stérilement les solutions d’anticorps pour FACS |
| Tube en polystyrène de 5 ml avec capuchon de filtre | Corning | 352235 | Utiliser pour éliminer les amas cellulaires avant l’utilisation de FACS |
| DAPI (préparé sous forme de stock de 1 mg/ml dans H2O) | Millipore | 268298 | Utiliser pour exclure les cellules mortes du tri |
| anti-souris CD16/CD32 (bloc FcR) | BD Biosciences | 553141 | Utilisation pour bloquer la coloration non spécifique aux récepteurs Fc |
| Anticorps pour le tri de l’indice AGM | |||
| Anti-souris CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Coloration du |
| rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Contrôle isotype pour CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-souris CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Coloration |
| du rat IgG2b kappa Contrôle de l’isotype, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Contrôle de l’isotype pour CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-souris CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Coloration |
| du rat IgG1 kappa Contrôle de l’isotype, PE | BD Biosciences | 553925 | Contrôle de l’isotype pour CD41 PE |
| Anti-souris CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Coloration du |
| rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Contrôle isotypique pour CD45 FITC |
| AGM-sérum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| facteur de cellules souches murines recombinantes (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Concentration finale 100 ng/ml |
| Ligand FLT3 humain recombinant (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Concentration finale 100 ng/ml |
| Thrombopoïétine humaine recombinante (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Concentration finale 20 ng/ml |
| interleukine-3 murine recombinante (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml de stock) Concentration finale 20 ng/ml |
| Matériaux pour la coloration des cellules co-cultivées | |||
| 96 plaque de puits, V-bottom | Corning | 3894 | Utilisation pour l’analyse FACS |
| Antibodies pour l’analyse de clones triés index co-cultivés avec des cellules endothéliales | |||
| Anti-souris CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Coloration du |
| rat IgG2b kappa Contrôle des isotypes, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Contrôle des isotypes pour CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-souris CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Coloration du |
| rat IgG2b kappa Contrôle des isotypes, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Contrôle des isotypes pour CD201 PE |
| Anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Coloration |
| rat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Contrôle de l’isotype pour Ly-6A/E APC |
| Anti-souris F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | |
| du rat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Contrôle de l’isotype pour F4/80 FITC |
| Anti-souris Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Coloration |
| rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Contrôle isotypique pour Ly-6G/C et CD3 FITC |
| Matériaux pour l’injection de la veine caudale pour la transplantation Seringues à insuline | |||
| 1/2 ml avec aiguilles 29G 1/2" | BD Biosciences | 309306 | Utilisation pour l’injection de la veine caudale pour la transplantation |
| Anticorps pour l’analyse du sang périphérique après translant | |||
| Anti-souris Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Coloration |
| du rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Contrôle d’isotype |
| pour Ly-6G/C PerCP Anti-souris F4/80 PE eBioscience 12-4801-82 ColorationRat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Contrôle de l’isotype pour F4/80 PE |
| Anti-souris CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Coloration |
| Anti-souris CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Coloration du |
| rat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, APC | BD Biosciences | 553932 | Contrôle de l’isotype pour CD19 APC |
| Anti-souris CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Coloration |
| du rat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Contrôle de l’isotype pour CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-souris CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Coloration |
| du rat IgG2a kappa Contrôle de l’isotype, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Contrôle de l’isotype pour CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II avec logiciel DIVA | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II avec lecteur de plaques | BD Biosciences | ||
| Hémocytomètre | Fisher | Scientific S17040 | Pour le comptage |
| de cellules Pipette multicanaux | Fisher Scientific | 14-559-417 | Pour logiciel |
| d’analyse FACS | de distribution FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |
Références
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development.
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Réimpressions et autorisations
