Klonede analyse af embryonale hæmatopoietisk stamcelle prækursorer ved hjælp af enkelt celle indeks sortering kombineret med endotel celle Niche Co kultur
Summary
Her præsenterer vi metode til klonede analyse af hæmatopoietisk stamcelle prækursorer under murine embryonale udvikling. Vi kombinere indeks sortering af enkelt celler fra embryonale aorta-gonade-mesonephros regionen med endotel Co cellekultur og transplantation til at karakterisere fænotypiske egenskaber og engraftment potentiale af enkelt hæmatopoietisk prækursorer.
Abstract
Evnen til at studere hæmatopoietisk stamcelle (HSC) genesis under fosterudviklingen har været begrænset af sjældenhed af HSC prækursorer i tidlig embryo og manglen på assays, der funktionelt identificerer den langsigtede multilineage engraftment potentiale enkelte formodede HSC prækursorer. Her, beskriver vi metoder, som gør det muligt for isolering og karakterisering af funktionelt validerede HSC prækursorer på enkelt celle-niveau. Først, vi udnytter indeks sortering for at katalogisere den præcise fænotypiske parameter for hvert individuelt sorteret celle, ved hjælp af en kombination af fænotypiske markører til at berige for HSC prækursorer med yderligere markører for eksperimentel analyse. Andet, hvert indeks-sorteret celle er co kulturperler med vaskulære niche stroma fra regionen aorta-gonade-mesonephros (AGM), som understøtter modning af ikke-engrafting HSC prækursorer til funktionelle HSC med multilineage, langsigtet engraftment potentiale i transplantation assays. Denne metode giver mulighed for korrelation af fænotypiske egenskaber af klonede hemogenic prækursorer med deres funktionelle engraftment potentiale eller andre egenskaber såsom transcriptional profil, giver dig mulighed for en detaljeret analyse af HSC forløber udvikling på enkelt celle-niveau.
Introduction
Klonede undersøgelser har afsløret heterogenitet i de langsigtede engraftment egenskaber af voksen HSCs, giver ny indsigt i HSC undertyper og ændringer i HSC adfærd under aldring1. Lignende undersøgelser af embryonale HSCs og deres prækursorer har dog været mere udfordrende. I den tidlige embryonale udvikling, HSCs opstår fra en population af prækursorer kendt som hemogenic endotel i en forbigående proces omhandlet som i endothelial hæmatopoietisk overgang2. Den første HSC, defineret ved deres evne til at yde robust, langsigtede multilineage engraftment efter transplantation i konditioneret voksen modtagere, registreres ikke før efter embryonale dag 10.5 (E10.5) i murine embryo, på meget lav frekvens3 . I løbet af deres udvikling, skal forstadier til HSC (pre-HSC) som følge af hemogenic endotelet underkastes modning forud erhverve voksen HSC egenskaber, som giver mulighed for effektiv engraftment i transplantation assays4,5 , 6. tilsløre studiet af sjældne HSC oprindelse, et væld af hæmatopoietisk stamfaderen med erythroid, myeloid, og lymfoide potentiale er allerede opdaget før fremkomsten af HSC fra pre-HSC7,8. Således kræver skelne pre-HSC fra andre hæmatopoietisk stamfaderen metoder til alsidighed isolere cellerne og forsyne dem med tilstrækkeligt for deres modning signaler til HSC, at opdage deres engraftment egenskaber i transplantation assays.
En række tilgange er blevet beskrevet som giver mulighed for påvisning af pre-HSC af ex vivo eller i vivo modning til HSC. Ex vivo metoder har afhang kultur af embryonale væv, såsom AGM-regionen, hvor den første HSC registreres i udvikling af9. Med udgangspunkt i disse metoder, protokoller, der inkorporerer dissociation, har sortering og re sammenlægning af AGM væv tilladt karakterisering af sorterede befolkninger der indeholder HSC prækursorer under udvikling fra E9.5 til E11.5 i para-aorta splanchnopleura (P-Sp) / AGM regioner4,5,10; men disse tilgange er ikke indstillet til høj overførselshastighed analyse af prækursorer på det enkelte celle niveau kræves for klonede analyse. Ligeledes, i vivo modning af transplantation til nyfødte mus, hvor mikromiljø formodes at være mere egnet til støtte for tidligere stadier af HSC prækursorer, har også aktiveret undersøgelser af sorterede befolkninger fra blommesækken og AGM / P-Sp (P-Sp er regionen forløber til generalforsamlingen) med Karakteristik af pre-HSC, men disse metoder også undlader at skabe en robust platform for enkelt celle analyse11,12.
Undersøgelser fra Rafii et al. demonstreret, at Akt-aktiveret endotel celle (EF) stroma kan give et niche substrat til støtte af voksen HSC selvfornyelse in vitro-13,14,15. Vi har for nylig besluttet, at Akt-aktiveret EF stammer fra regionen AGM (AGM-EF) giver en passende in vitro- niche for modning af hemogenic prækursorer, isoleret så tidligt som E9 i udvikling til voksen-engrafting HSC, samt den efterfølgende Self-fornyelse af genererede HSC16. Da dette system benytter en simpel 2-dimensionelle fælles kultur, er det let kan tilpasses for klonede analyse af HSC potentiale af individuelt isolerede hemogenic prækursorer.
Vi har for nylig rapporteret en tilgang til analysen af klonede hemogenic prækursorer HSC potentiale ved at kombinere indeks sortering af individuelle hemogenic prækursorer fra murine embryoner med AGM-EF Co kultur og efterfølgende funktionalanalyse i transplantation -undersøgelser,17. Indeks sortering er en tilstand af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) der optager (indekser) alle fænotypiske parametre (dvs., forward scatter (FSC-A), side scatter (SSC-A), fluorescens parametre) for hvert individuelt sorteret celle, sådan at disse funktioner kan være med tilbagevirkende kraft korreleret til efterfølgende funktionel analyse efter sortering. FACS software registrerer både fænotypiske oplysninger for hver celle og position/brønd af 96-brønd plade, hvor det var placeret. Denne teknik er tidligere blevet elegant brugt til at identificere heterogenitet i voksen HSC, bestemme fænotypiske parametre, der yderligere berige for den langsigtede engrafting delmængde af HSC, og korrelere fænotypiske parametre af HSC med transcriptional egenskaber på indre celle niveau18,19. Her, leverer vi detaljeret metode for denne tilgang, der muliggør identifikation af unikke fænotypiske parametre og afstamning bidrag af pre-HSC i tidlige stadier af embryoets udvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiet af HSC genesis under fosterudviklingen nødvendiggør midler til at opdage HSC potentielle i hemogenic prækursorer endnu mangler kompetence til at give langsigtede multilineage hæmatopoietisk rekonstituering i transplanterede voksen modtagere. I denne protokol præsenterer vi en klonal analysen af embryonale hemogenic prækursorer af stromale Co kultur på vaskulære niche ECs fra den ordinære generalforsamling, som understøtter modning af prækursorer til HSC, med efterfølgende funktionalanalyse i transplan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Andrew Berger, Stacey Dozono og Brian Raden i Fred Hutchinson Flow flowcytometri kernen for bistand med FACS. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed NHLBI UO1 grant #HL100395, accessoriske Collaborative Grant #HL099997, og NIDDK at give #RC2DK114777. Brandon Hadland understøttes af Alexs limonade stå Foundation og Hyundai Hope på hjul Foundation.
Materials
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
References
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
- Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
- Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
- Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
- Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
- Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
- Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
- Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
- Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
- Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
- deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
- Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
- Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
- Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
- Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
- Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
- Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).
