पूर्व Vivo इमेजिंग प्रयोगों के लिए वयस्क Zebrafish से ताजा रेटिना स्लाइस की तैयारी
Summary
इमेजिंग रेटिना ऊतक एकल सेल जानकारी है कि पारंपरिक जैव रासायनिक तरीकों से इकट्ठा नहीं किया जा सकता प्रदान कर सकते हैं । यह प्रोटोकॉल zebrafish से रेटिना स्लाइस के लिए फोकल इमेजिंग की तैयारी का वर्णन करता है । फ्लोरोसेंट आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर या संकेतक रंजक अलग रेटिना सेल प्रकार में कई जैविक प्रक्रियाओं के दृश्य की अनुमति देते हैं ।
Abstract
रेटिना एक जटिल ऊतक है कि शुरू और दृष्टि के पहले कदम को एकीकृत है । रेटिना कोशिकाओं की शिथिलता कई चकाचौंध रोगों की एक बानगी है, और भविष्य के उपचार कैसे अलग रेटिना कोशिकाओं सामान्य रूप से कार्य के बारे में मौलिक समझ पर टिका. जैव रासायनिक तरीकों के साथ इस तरह की जानकारी प्राप्त करना मुश्किल साबित हो गया है क्योंकि विशेष कोशिका प्रकार के योगदान रेटिना सेल वातावरण में कम कर रहे हैं. लाइव रेटिना इमेजिंग एक सेलुलर स्तर पर कई जैविक प्रक्रियाओं का एक दृश्य प्रदान कर सकते हैं, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट जैव संवेदी की बढ़ती संख्या के लिए धन्यवाद. हालांकि, इस तकनीक को इस प्रकार अब तक सीमित किया गया है tadpoles और zebrafish लार्वा, अलग रेटिना की सबसे बाहरी रेटिना परतों, या कम रहने जानवरों में रेटिना का रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग । यहाँ हम लाइव इमेजिंग के लिए वयस्क zebrafish से फोकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से लाइव पूर्व वीवो रेटिना स्लाइसें पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । यह तैयारी सभी रेटिना परतों और सबसे सेल प्रकार छिड़काव का उपयोग कर फोकल इमेजिंग प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए दृश्यमान के साथ अनुप्रस्थ स्लाइस पैदावार । ट्रांसजेनिक zebrafish में फ्लोरोसेंट प्रोटीन या विशिष्ट रेटिना सेल प्रकार या organelles में संवेदी व्यक्त करने के लिए एक बरकरार रेटिना से एकल सेल जानकारी निकालने के लिए उपयोग किया जाता है । इसके अतिरिक्त, रेटिना स्लाइस फ्लोरोसेंट संकेतक रंजक के साथ लोड किया जा सकता है, विधि की बहुमुखी प्रतिभा को जोड़ने. इस प्रोटोकॉल इमेजिंग ca के लिए विकसित किया गया था2 + zebrafish शंकु photoreceptors के भीतर, लेकिन उचित मार्करों के साथ इसे मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता ca2 + या चयापचयों म्यूलर कोशिकाओं में, द्विध्रुवी और क्षैतिज कोशिकाओं, microglia, amacrine कोशिकाओं, या रेटिना नाड़ीग्रंथि कक्ष । इस विधि उस कक्ष प्रकार का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं है तो रेटिना वर्णक उपकला स्लाइस से निकाल दिया गया है । अभ्यास के साथ, यह कई प्रयोगों के लिए एक जानवर से धारावाहिक स्लाइसें उत्पन्न करने के लिए संभव है. यह अनुकूलनीय तकनीक रेटिना सेल जीव विज्ञान, सीए2 +, और ऊर्जा homeostasis के बारे में कई सवालों के जवाब देने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है ।
Introduction
zebrafish (ढाणियो rerio) व्यापक रूप से चिकित्सा और बुनियादी वैज्ञानिक अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है1, अपने छोटे आकार, तेजी से विकास और हड्डीवाला अंग प्रणालियों के कारण । transgenesis के लिए स्थापित तरीकों के साथ संयुक्त zebrafish लार्वा की प्राकृतिक पारदर्शिता एक जीवित जानवर में सेलुलर प्रक्रियाओं का विस्तृत दृश्य सक्षम है । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट के एक नंबर सेंसर विशिष्ट zebrafish कोशिकाओं को लक्षित किया गया है Ca2 + 2, हाइड्रोजन पेरोक्साइड3, अपोप्तोटिक सक्रियकरण4 और एटीपी5का पता लगाने ।
vivo में इमेजिंग zebrafish लार्वा तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में सफलताओं के लिए नेतृत्व किया गया है, मस्तिष्क सर्किट6 और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकारों7के लिए दवा विकास की मानचित्रण सहित । Zebrafish दृष्टि अनुसंधान के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि उनके रेटिना लामिना संरचना और उच्च रीढ़ के ंयूरॉन प्रकार की सुविधा है, और वे मजबूत दृश्य व्यवहार8,9प्रदर्शन । मानव रोग के अनुरूप रेटिना अध ‘ के कई प्रकार के सफलतापूर्वक मॉडलिंग की गई है और zebrafish में अध्ययन किया गया है10,11, एक रेटिना2के भीतर व्यक्तिगत photoreceptors चूकने की लाइव इमेजिंग सहित, 12.
vivo लार्वा zebrafish इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण उपकरण है, यह मछली बढ़ने और रंजकता विकसित करने के रूप में और अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है, और कुछ औषधीय उपचार एक पूरे जानवर रिस नहीं कर सकता. इसके अलावा, कुछ सेलुलर विकास और उंर के साथ परिवर्तन प्रक्रियाओं, बाद में समय समझने समारोह और वयस्क पशुओं में रोग की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण अंक बना । immunoblot, quantitiative पीसीआर, ओ2 खपत, और metabolomic विश्लेषण के रूप में जैव रासायनिक तरीकों के रूप में एक पूरे के रूप में रेटिना के जीव विज्ञान के बारे में महत्वपूर्ण सुराग प्रदान कर सकते हैं, लेकिन यह अलग से प्रभावित कोशिका प्रकार के योगदान विचार मुश्किल है रोग. इमेजिंग पृथक रेटिना ऊतक पूर्व vivo इन मुद्दों को नजरअंदाज कर, और जबकि इमेजिंग फ्लैट घुड़सवार रेटिना के बाहरी रेटिना13के एक दृश्य affords, गहरे भीतरी रेटिना सुविधाओं अस्पष्ट हैं. अनुप्रस्थ ऐसे निश्चित immunohistochemical विश्लेषण में प्रस्तुत उन के रूप में रेटिना स्लाइस, सभी परतों और कोशिकाओं के प्रकार के एक स्पष्ट दृश्य सक्षम है, लेकिन केवल गतिशील सामांय समारोह और रोग में शामिल प्रक्रियाओं का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं ।
यहां, हम इमेजिंग के लिए वयस्क zebrafish से पूर्व vivo अनुप्रस्थ रेटिना स्लाइस पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । यह electrophysiological और रूपात्मक अध्ययन के लिए amphibian और zebrafish रेटिना स्लाइस की तैयारी के लिए तरीकों के समान है14,15, समय के लिए महत्वपूर्ण संशोधनों के साथ चूक इमेजिंग पूर्व vivo का उपयोग कर फोकल माइक्रोस्कोपी. छिड़काव का उपयोग कर औषधीय एजेंटों देने जबकि एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ वास्तविक समय में निगरानी कर रहे हैं स्लाइस में प्रतिदीप्ति या रंजक के जवाब. जबकि विधि इमेजिंग photoreceptors के लिए विकसित किया गया था, यह उपयुक्त फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ म्यूलर कोशिकाओं, द्विध्रुवी कोशिकाओं, क्षैतिज कोशिकाओं, amacrine कोशिकाओं, या रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं visualizing के लिए इसका इस्तेमाल करने के लिए संभव हो सकता है. इसके अतिरिक्त, स्लाइस को सेल व्यवहार्यता, vesicular परिवहन, mitochondrial समारोह, या redox राज्य की रिपोर्ट करने के लिए फ्लोरोसेंट सेल-पारगंय रंजक के साथ लोड किया जा सकता है । यह बहुमुखी तैयारी रेटिना भर उपसेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के दृश्य की अनुमति देता है, Ca2 + गतिशीलता, संकेत transduction और चयापचय राज्य सहित.
Protocol
Representative Results
Discussion
ताजा zebrafish रेटिना स्लाइस की पूर्व vivo इमेजिंग photoreceptor जीव विज्ञान20,21,22के अध्ययन के लिए एक बहुमुखी उपकरण साबित हो गया है, और है कि यह एक परिपक्व में एकल कोशिकाओं का विश्लेष…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल विकसित करते हुए, और ईवा Ma, एशले जॉर्ज और गेल Stanton स्थिर ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों की पीढ़ी के लिए राल्फ नेल्सन और डैनियल Possin विचारशील मार्गदर्शन के लिए धंयवाद । इस कार्य को NSF GRFP २०१३१५८५३१ से M.G., NIH नेि 5T32EY007031 को W.C. और M.G. को, और EY026020 को J.H. और S.B. को समर्थन दिया गया
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
References
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