Zellmembran Reparatur Assays mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop
Summary
Zellmembran Verwundung über zwei-Photonen-Laser ist eine weit verbreitete Methode für die Bewertung der Membran Wiederverschließen Fähigkeit und kann auf mehrere Zelltypen angewendet werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für in-vitro- live-Aufnahmen von Membran Wiederverschließen in Dysferlinopathie Patientenzellen nach zwei-Photonen-Laser-Ablation.
Abstract
Zahlreichen pathophysiologische Beleidigungen können Zellmembranen schädigen und Verbindung mit angeborenen Defekten in Zellmembran Reparatur oder Integrität, können zu Krankheit führen. Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die umgebenden Zellmembran Reparatur ist daher ein wichtiges Ziel für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Erkrankungen, die mit dysfunktionalen Zellmembran Dynamik. Viele in Vitro und in Vivo Studien zum Ziel zu verstehen, Zellmembran Wiederverschließen Krankheit Kontexten nutzen zwei-Photonen-Laser-Ablation als Standard für die Bestimmung der funktionellen Ergebnisse nach experimentellen Behandlungen. In diesem Assay unterliegen Zellmembranen Verwundung mit einem zwei-Photonen-Laser, wodurch die Zellmembran zu Bruch und fluoreszierenden Farbstoff in die Zelle einzudringen. Die Intensität der Fluoreszenz in der Zelle kann dann überwacht werden, um die Fähigkeit der Zelle zu verschließen sich quantifizieren. Gibt es mehrere alternative Methoden für die Beurteilung der Zellmembran als Reaktion auf Verletzungen, als auch große Unterschiede in der zwei-Photonen-Laser Verwundung Ansatz selbst, daher würde ein einheitliches Modell der Zelle Verwundung nutzbringend zu verringern dienen der Unterschiede zwischen den beiden Methoden. In diesem Artikel beschreiben wir einen einfache zwei-Photonen-Laser Verwundung Protokoll für die Beurteilung der Zellmembran Reparatur in Vitro in beide gesund und Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten, Zellen mit oder ohne ein in voller Länge Dysferlin-Plasmid transfiziert.
Introduction
Die Zellmembran der eukaryotischen Zellen besteht aus einer Doppelschicht Protein besetzte Phospholipide, die definiert der Intra-/extrazellulären Umgebung der Zelle und ist unerlässlich für die Aufrechterhaltung der zelluläre Homöostase und Zelle überleben. Zellmembran Verletzungen infolge mechanischer oder chemischer Beleidigungen sind an der Tagesordnung in verschiedenen Säugetier-Zelle Arten, einschließlich Skelett- und Herzmuskulatur, Magen und Lunge Zellen1,2,3,4. Neben Verletzungen konsequente tägliche physiologische Funktion können Zellmembranen auch durch ökologische Beleidigungen, bakterielle Toxine und ischämische Reperfusion5beschädigt werden. Brüche in der Zellmembran verschließen führt zu einem unregulierten Zustrom von extrazellulären Ca2 +– zusammen mit anderen potentiell toxischen extrazellulären Komponenten – in die Zelle auslösen nachgeschalteter Signalkaskaden, die schnell in Zelle führen kann Tod,1,4,5,6.
Bisher gab es mehrere vorgeschlagenen Modelle für Membran-Reparatur in den Zellen. Je nach Größe und Art der Membran Ruptur können verschiedene Reparaturmechanismen aktiviert werden. Es wird beispielsweise vorgeschlagen, Zellmembranen lateral Flow oder Protein um kleine Störungen beheben Verstopfung nutzen kann (< 1 nm). Die laterale Fusion-Modell schlägt vor, dass Membran Brüche durch die seitliche Einstellung des Dysferlin-haltigen schnell geflickt sind Membran7, während das Protein Verstopfung Modell schlägt vor, dass kleine Perforationen durch Protein Aggregationen geflickt werden (meist Polymerasen) 8. dagegen größere Membran Läsionen auslösen Ca2 +-abhängige, Dysferlin-vermittelten Vesicle Fusion und Bildung eines Reparatur-Patch. In der Reparatur-Patch-Modell löst ein schnelle Ca2 + Zustrom in die Zelle die Rekrutierung von mehrere Proteine (Dysferlin Polymerasen, Mitsugumin-53 und EDH Proteine) bilden ein komplexes oder “Patch”, zusammen mit einer Fusion von intrazellulären Vesikeln oder Lysosomen an der Stelle der Membran beschädigt werden4,9,10,11,12. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Modelle nicht notwendigerweise gegenseitig ausschließen sind und in Konzert funktionieren, Membran-Reparatur zu erleichtern. Nichtbeachtung der Zellmembran Schäden ordnungsgemäß zu verschließen ist verbunden mit mehreren Krankheitszuständen, einschließlich Muskeldystrophie (Dysferlinopathie – einschließlich Miyoshi Myopathie, Gliedmaßen-Gürtel Muskeldystrophie Typ IIB und distalen Myopathie mit vorderen tibiale einsetzen) 13, Kardiomyopathie14und Chediak-Higashi-Syndrom (CHS)15.
In Anbetracht, dass richtige Zellmembran Integrität und Wiederverschließen spielt eine wichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit, ein tieferes Verständnis für die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Zellmembran Reparatur nützlich bei der Suche nach neue therapeutische Strategien wäre. Deshalb ist es notwendig, geeignete experimentelle Techniken zur Überwachung der Kinetics und bewerten die Fähigkeit der Zellmembran Reparatur zu besitzen. Mehrere in-vitro- Methoden zur Modellierung von Membran-Reparatur sind entworfen worden. Eine Strategie beinhaltet die mechanische Verletzungen, die durch die Zelle zu kratzen, mit einer Pipette/chirurgische Messer/Rasiermesser oder durch die Zellen16Glasperlen überrollen erleichtert werden kann. Jedoch diese Art von mechanischen Verletzungen erzeugt größere Läsionen, und schafft ein hohes Maß an Variation Zelle Verletzung, sowohl innerhalb als auch zwischen den Kulturen.
Eine weitere Methode zur Generierung von Membran Wunden ist Laser-Ablation durch zwei-Photonen-Mikroskopie. Im Gegensatz zu traditionellen konfokale Lasermikroskopie, das einzelne Photon Erregung beschäftigt, nutzt die zwei-Photonen-Laser gleichzeitig zwei langwellige, Niedrigenergie-Photonen, um die Anregung einer hochenergetischen Elektronen17zu erleichtern. Diese nichtlinearen Prozess führt zu Erregung ausschließlich in der Brennebene und nicht entlang der gesamten Lichtweg17 (Abbildung 1). Dies reduziert Erregung Volumen hilft lichtbedingten minimieren beim lebenden Zellen18,19abbilden. Forscher sind daher in der Lage, präzise Läsionen in der Zellmembran und Monitor Membran Wiederverschließen in Echtzeit durch die Verwendung von fluoreszierender Farbstoffen und Beobachtung von Veränderungen in der Fluoreszenzintensität als die Zellmembran Brüche und dann Sicherheitsventilen zu generieren.
Dieser Ansatz wurde wiederholt verwendet, um die Membran Verwundung in Vitro und in Vivo zu untersuchen und mehrere Zelle eingibt20,21. Z. B. Membran reparieren defekte in Fibroblasten und Myotubes, abgeleitet von Dysferlinopathie, die Patienten wurden anhand dieser Technik22,23. Darüber hinaus wurden einzelne Muskelfasern von Mäusen isoliert verwendet, um Reparatur Patch Bildung13,24,25zu überwachen. Die Bewegung der Gewebekulturen tagged Proteine kann auch während der Reparatur der Membran in einzelnen Muskelfasern9beobachtet werden. Darüber hinaus kann der Prozess der sarcolemmal Reparatur nach zwei-Photonen-Laser Verwundung in den Zebrafish Embryos in Echtzeit in Vivo26beobachtet werden.
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methodik für die Bewertung der Zellmembran Reparatur Dynamik in Fibroblasten mit zwei-Photonen-Laser verletzt wurden, obwohl diese Methodik zu verschiedenen Zelltypen zur Quantifizierung der Plasmamembran Wiederverschließen Fähigkeit angewendet werden können in Vitro. Bei dieser Methode werden mit FM4-64 Zellen inkubiert, ein lipophiler, Zelle-undurchlässigen Farbstoff, der schnell fluoresziert wie es an negativ bindet aufgeladen Phospholipide im Zytoplasma beim Eintritt in der Zelle durch die Membran-Läsion (Abbildung 2& 3). Quantifizierung der Farbstoff Fluoreszenz angrenzend an die Membran Läsion ermöglicht eine Überwachung der Zeit, die für die Zellmembran zu selbst zu verschließen. Um das Dienstprogramm dieser Methode zu veranschaulichen, verwenden wir Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten transfiziert mit GFP konjugiert in voller Länge Dysferlin (DYSF) Plasmide um die Rettung der Zellmembran Reparatur zu beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zwei-Photonen-Laser Verwundung der Zellmembran ist eine genaue und vielseitige Technik für die Beurteilung der Dynamik der Membran Wiederverschließen in Vitro. In diesem Artikel beschriebenen wir ein Protokoll für die Bestimmung der Zellmembran Wiederverschließen Fähigkeit in Dysferlinopathie Patientenzellen mit dem zwei-Photonen-Laser Verwundung Assay. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Dysferlinopathie Patienten Zellen Defekt in Zellmembran Wiederverschließen, das steht im Einklang mit Ergebnissen von andere…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Universität von Alberta Fakultät für Medizin und Zahnmedizin, die Freunde von Garrett Cumming Stuhl Forschungsfonds, HM Toupin neurologische Forschung Stuhl Wissenschaftsfonds, muskulöse Dystrophie Kanada, Canada Foundation für Innovation (CFI) unterstützt, Alberta erweiterte Bildung und Technologie (AET), kanadische Institute der Gesundheitsforschung (CIHR), Jesse Reise – die Grundlage für gen und Zelltherapie, die Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI) und Alberta Health Solutions (AIHS erneuert ).
Wir möchten Dr. Steven Laval danken für die Bereitstellung von uns mit dem Full-length Dysferlin-Plasmid. Wir möchten auch Dr. Katsuya Miyake für technische Beratung bedanken.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
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