Assay ремонт мембраны клеток с помощью двух Фотон лазерный микроскоп
Summary
Клеточной мембраны, ранив через два фотона лазерного это широко используемый метод для оценки мембраны закрытия способности и может быть применен к нескольким типов клеток. Здесь мы описываем протокол в vitro жить изображений запечатывания мембраны в клетках пациента dysferlinopathy, после двух Фотон лазерной абляции.
Abstract
Многочисленные патофизиологические оскорбления может привести к повреждению мембраны клеток и, в сочетании с врожденными дефектами в ремонте клеточной мембраны или целостности, может привести к болезни. Таким образом, понимание глубинные механизмы окружающих клеточной мембраны ремонта является важной задачей для развития новых терапевтических стратегий для заболеваний, связанных с динамикой неблагополучных клеточной мембраны. Многие в пробирке и в vivo исследований, направленных на понимание клеточной мембраны запечатывания в различных контекстах болезни используют два Фотон лазерной абляции в качестве стандарта для определения функциональных результатов после экспериментального лечения. В этот assay мембраны клетки подвергаются ранив двух Фотон лазером, что приводит к клеточной мембраны к разрыву и флуоресцентные краски проникнуть в клетки. Интенсивность флуоресценции в ячейке затем может контролироваться количественно оценить способность клеток запечатать сам. Существует несколько альтернативных методов для оценки клеточной мембраны ответ на травмы, а также большие различия в двух фотона лазерного, ранив сам подход, таким образом, единой модели ранения клетки благотворно будет служить для снижения различия между этими методологиями. В этой статье мы приводим простой лазерной двух фотонов, ранив протокол для оценки клеточной мембраны ремонт в vitro как здоровых, так и dysferlinopathy пациента фибробластов что transfected клеток с или без полнометражные dysferlin плазмиды.
Introduction
Клеточной мембраны эукариотической клетки состоит из двухслойной белка шипованных фосфолипидов который определяет intra/внеклеточных среды ячейки и имеет важное значение для поддержания клеточного гомеостаза и ячейку выживания. Клеточной мембраны травм, связанных с механической или химической оскорбления являются обычным явлением в различных типах клеток млекопитающих, включая скелетных и сердечной мышцы, желудка и легких клетки1,2,3,4. Помимо травмы в результате ежедневных физиологические функции клеточных мембран также могут быть повреждены экологической оскорбления, бактериальные токсины и ишемии-реперфузии5. Неспособность запечатать разрывов в клеточной мембраны ведет к нерегулируемый приток внеклеточного Ca2 +– наряду с других потенциально токсичных компонентов внеклеточного – в клетку, вызывая течению сигнала каскады, которые могут быстро привести к ячейке смерти1,4,5,6.
На сегодняшний день, были несколько предложенных моделей для ремонта мембраны в клетках. Ремонт различных механизмов могут активироваться в зависимости от размера и характера разрыва мембраны. Например, предполагается, что клеточные мембраны могут использовать боковое поток или белка, засорение для ремонта небольших сбоев (< 1 Нм). Модель бокового fusion предлагает, что мембрана разрывы быстро зашли через боковые набора dysferlin содержащих мембраны7, в то время как белок, засорение модель предполагает, что небольшие проколы рекомендованный через агрегаты белка (в основном Аннексины) 8. и наоборот, более крупные поражения мембраны триггер Ca2 +-зависимых, dysferlin опосредованной везикул фьюжн и формирование патч ремонт. В модели патч ремонт, быстрый Ca2 + приток в ячейку запускает набор нескольких белков (dysferlin, аннексины, mitsugumin-53 и EDH белки), которые образуют комплекс или «патч», наряду с сочетанием внутриклеточных везикулы или на сайте мембраны лизосом ущерб4,9,10,,1112. Важно отметить, что эти модели не обязательно являются взаимоисключающими и могут работать в концерте для облегчения ремонта мембраны. Неспособность должным образом запечатать повреждение клеточной мембраны связан с несколькими государствами болезни, включая мышечная дистрофия (dysferlinopathy – включая Миеси миопатии и конечности ремень мышечная дистрофия типа IIB дистальная миопатия с передней большеберцовой начала) 13,14кардиомиопатия и Чедиака-Хигаси синдром (CHS)15.
Учитывая, что целостность надлежащего клеточной мембраны и запечатывания играет такую важную роль в здоровье и болезни, более глубокое понимание глубинные механизмы клеточной мембраны ремонта бы полезно в поисках роман терапевтических стратегий. Это, таким образом, необходимо иметь соответствующие экспериментальные методы для мониторинга кинетики и оценить способность клеточной мембраны ремонта. Были разработаны несколько в vitro методы для моделирования мембраны ремонт. Одна стратегия включает механические травмы, которая может способствовать клеток соскоб с пипеткой/хирургическое лезвие/бритвой или путем опрокидывания клетки16стеклянные бусины. Однако этот тип механических повреждений генерирует большие поражения и создает высокую степень изменчивости в ячейке травмы, как внутри, так и между культурами.
Другой способ генерации мембраны раны является лазерной абляции, два Фотон микроскопии. В отличие от традиционного лазера confocal микроскопии, которая использует один фотон возбуждения два фотона лазерного одновременно использует две длинные волны, низкой энергии фотонов для облегчения возбуждения электронов17. Этот нелинейный процесс приводит возбуждения исключительно в пределах фокальной плоскости и не вдоль всего пути света17 (рис. 1). Это сократило объем помогает возбуждение к минимуму фотоповреждения при визуализации живых клеток18,19. Поэтому исследователи способны генерировать точного поражения в клеточной мембраны и монитор мембраны запечатывания в режиме реального времени с помощью флуоресцентных красителей и наблюдения изменений в интенсивности флуоресценции клеточной мембраны разрывы, а затем reseals.
Этот подход неоднократно использовались для изучения мембраны, ранив в пробирке и в естественных условиях и в несколько ячеек типы20,21. Например мембран ремонта дефектов фибробластов и myotubes, производный от dysferlinopathy, которую больных оценивали с помощью этой техники22,23. Кроме того один мышечных волокон, изолированные от мышей были использованы для мониторинга ремонт патч формирования13,24,25. Движение дневно тегами белков может также наблюдаться во время ремонта мембраны в одном мышечных волокон9. Кроме того процесс sarcolemmal восстановления после двух фотона лазерного ранения в zebrafish эмбриона можно наблюдать в режиме реального времени в vivo26.
В этой статье мы приводим методологию для оценки динамики ремонт клеточной мембраны в фибробласты, используя два фотона лазерного ранения, хотя эта методология может применяться для различных типов клеток с целью количественного определения плазматической мембраны запечатывания способность в пробирке. В этом методе, клетки инкубируют с FM4-64, липофильных, клетки непроницаемый краситель, который быстро флуоресцирует как он привязывается к отрицательно заряженных фосфолипидов в цитоплазме при входе в клетку через мембраны поражения (рис. 2& 3). Количественная оценка краситель флуоресценции рядом с поражением мембраны позволяет для наблюдения за время, которое требуется для клеточной мембраны для запечатывания сам. Чтобы проиллюстрировать полезность этого метода, мы используем dysferlinopathy пациента фибробластов transfected с плазмид GFP-конъюгированных полнометражные dysferlin (DYSF) для оценки спасательных ремонт клеточной мембраны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Двух фотона лазерного ранив клеточной мембраны — это точный и универсальный метод для оценки динамики мембранных запечатывания в пробирке. В этой статье мы описали протокол для определения запечатывания способности в dysferlinopathy пациента клеток с помощью двух Фотон лазера, ранив пр…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана университета Альберты факультета медицины и стоматологии, Гарретт Камминг исследований кафедры Фонд друзей, HM Toupin неврологических науки исследований стул фонд, мышечная дистрофия Канады, Канадский фонд для инноваций (CFI), Альберта передовых образования и технологий (AET), канадский институтов медицинских исследований (КНИИЗ), Джесси путешествие – основу для гена и клеточной терапии, женщин и детей в области здравоохранения научно-исследовательский институт (WCHRI), и Альберта инновационную решения (AIHS здоровье ).
Мы хотели бы поблагодарить д-р Стивен Laval для поставлять нам полнометражные dysferlin плазмиды. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Katsuya Miyake за технические консультации.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm collagen-coated glass-bottom dishes | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Dye | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s Salts Solution | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Two-photon laser | Coherent | NA |
References
- Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
- McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).
- Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).
- Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
- McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).
- McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).
- Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).
- Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).
- Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
- Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).
- Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).
- Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).
- Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).
- Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).
