Essai de réparation Membrane cellulaire à l’aide d’un Microscope biphotonique Laser

Résumé

Membrane cellulaire blessant par deux photons laser est une méthode largement utilisée pour évaluer la capacité de fermeture membrane et peut être appliquée à plusieurs types de cellules. Nous décrivons ici un protocole pour in vitro en direct-imagerie de membrane réapposition de sceau sur dysferlinopathy patients cellules après l’ablation de deux photons laser.

Résumé

Nombreuses insultes physiopathologiques peuvent causer des dommages aux membranes cellulaires et, lorsqu’il est couplé avec des défauts innées dans la réparation de la membrane cellulaire ou l’intégrité, peuvent entraîner la maladie. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents qui entourent la réparation de la membrane cellulaire est donc un objectif important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies liées à la dynamique de la membrane de cellules dysfonctionnelles. De nombreuses études in vitro et in vivo , afin de comprendre la membrane cellulaire rescellage dans divers contextes de maladie utilisent ablation laser deux photons comme une norme pour la détermination des résultats fonctionnels après des traitements expérimentaux. Dans cet essai, membranes cellulaires subissent coups et blessures avec un laser à deux photons, qui provoque la membrane cellulaire se rompre et colorant fluorescent s’infiltrer dans la cellule. L’intensité de la fluorescence au sein de la cellule peut être ensuite surveillée afin de quantifier la capacité de la cellule à se refermer. Il existe plusieurs autres méthodes pour évaluer la réponse de membrane cellulaire à des blessures, ainsi que grande variation dans le deux photons laser blessant approche lui-même, par conséquent, un modèle unifié de cellule blessant servirait avantageusement pour diminuer la variation entre ces méthodes. Dans cet article, nous décrivons un laser à deux photons simple blessant protocole pour évaluer la membrane cellulaire réparation in vitro à la fois sain et dysferlinopathy patients fibroblastes cellules transfectées avec ou sans un plasmide dysferline pleine longueur.

Introduction

La membrane cellulaire des cellules eucaryotes est constitué d’une double couche de phospholipides parsemées de protéine qui définit l’environnement intra/extracellulaire de la cellule et est essentielle pour maintenir la survie cellulaire de l’homéostasie et de la cellule. Membrane cellulaire blessures dus aux insultes mécaniques ou chimiques sont monnaie courante dans les divers types de cellules de mammifères, y compris squelettique et muscle cardiaque, estomac et poumon cellules^1,2,3,4. En plus des blessures consécutives à une fonction p....

Protocole

Cellules fibroblastiques humaines utilisées dans cette étude ont été utilisés avec l’approbation de la Commission d’éthique humaine de la faculté de médecine et de dentisterie de l’Université de l’Alberta.

1. la transfection des cellules avec le plasmide DYSF pleine longueur

1. Cellules fibroblastes en culture dans un flacon de T225 contenant 40 mL de milieux de culture - Eagle modifié (DMEM) de 36 mL Dulbecco, 4 mL de sérum fœtal (SVF) et 20 µL de pénicilline/streptomycine (P/S) - dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C.
   Remarque : Les cellules doivent être cultivés à environ 70-80 % confluence et ne puissent pas devenir c....

Résultats

Les fibroblastes humains en bonne santé, fibroblastes de patients non traités dysferlinopathy et patients fibroblastes transfectées avec un plasmide contenant la séquence de la dysferline pleine longueur ont été soumis à deux photons laser blessant pour évaluer la membrane rescellage capacité en temps réel. Cellules de fibroblaste humain sain affichent faibles niveaux d’activation de fluorescence FM 4-64 après laser blessant et de fibroblastes de patients non traités présentaient un haut .......

Discussion

Deux photons laser blessant de la membrane cellulaire est une technique précise et polyvalente pour évaluer la dynamique de la membrane rescellage in vitro. Dans cet article, nous avons décrit un protocole pour déterminer la membrane de la cellule rescellement de capacité dans les cellules de patients dysferlinopathy en utilisant le deux photons laser blessant dosage. Nos résultats montrent que les patients cellules dysferlinopathy sont défectueuses dans la membrane cellulaire de réapposition de sceau, qui est c.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
Sérum de veau fœtal	Sigma-Aldrich	F1051
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Thermo Fisher	15140122
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol	Thermo Fisher	25300062
Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate	Sigma-Aldrich	D8537
35mm Plats à fond en verre recouverts de collagène	MatTek	P53GCOL-1.5-14-C
Milieu privé de sérum	Thermo Fisher	31985070
réactif de transfection	Thermo Fisher	15338100
FM 4-64 Colorant	Invitrogen	T13320
Tyrode' s Salts Solution	Sigma-Aldrich	T2397
Microscope confocal à balayage laser	Carl Zeiss	NA
Chameleon Laser à deux photons	Coherent	NA