생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화
Summary
이 프로토콜에서 잠재 Sf9 세포로 잠재 플라스 미드의 과도 transfection에 의해 생산 이며 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 증폭. 상쾌한 덤플링 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 하 고 ultracentrifugation에 의해 더 집중. 이 프로토콜은 생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화에 대 한 유용 합니다.
Abstract
잠재는 전통적으로 재조합 단백질 및 백신의 생산을 위해 사용 되었습니다. 그러나, 최근에, 잠재 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 유망한 벡터로 떠오르고 있다. 여기, 잠재 Sf9 세포의 부착 문화에 잠재 플라스 미드 DNA (bacmid)의 과도 transfection에 의해 생산 됩니다. 원하는 볼륨을 얻을 때까지 잠재 이후에 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 Sf9 셀에 확장 됩니다. 그것은 다음 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 표면에 뜨는 문화에서 정화. 바이러스 표면에 뜨는 잠재 봉투 당단백질에 대 한 상쾌한 덤플링의 선호도 때문에 잠재 입자를 바인딩하는 덤플링 열에 로드 됩니다. 열 오염 물질을 제거 하는 버퍼와 세척 하 고 높은 소금 버퍼 열에서 잠재는 eluted. eluate isotonic 소금 농도를 희석 하 고 잠재 입자는 더 ultracentrifugation를 사용 하 여 집중. 이 메서드를 사용 하 여 잠재 전염 성 입자의 25% 회복으로 최대 500-fold 집중 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 1 L 문화에서 생산 고는 잠재의 정화를 보여줍니다, 하지만 메서드 수 수 확장-최대 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 임상 등급 벡터를 생산 하기 위해 폐쇄 시스템 정지 문화.
Introduction
잠재는 lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9에서에서 백신 및 재조합 단백질의 생산을 위해 주로 사용 된다 재조합 Autographa californica multicapsid 핵 polyhedrosis 바이러스 (AcMNPV)를 사용 하 여 곤충 세포 1 , 2 , 3 , 4. 최근에, 그것은 유전자 치료 응용 프로그램5에 대 한 유망한 벡터로 나오고. 광범위 한 호스트 및 조직 차 있는 굴곡 운동 것으로 알려져, 무부하 및 확산 세포 감염, 비 병원 성 이며 호스트 염색체4,,56으로 통합 하지 않습니다. 또한, 잠재 미래 임상 생산1처리 폐쇄 시스템에 대 한 확장 가능 하 혈 청 무료 서 스 펜 션 문화에서 생산 수 있습니다.
잠재 입자의 순수성은 세포 독성7,,89를 최소화 하면서 효과적인 변환 달성 하기 위한 중요 합니다. 잠재는 ultracentrifugation 또는 접선 교류 여과 (TFF)는 infectivity에 제한 된 영향에 의해 집중 될 수 있습니다. 그러나,이 절차는 뿐만 아니라 바이러스 입자를 집중 하지만 또한 세포 파편과 단백질 Sf9에서 문화, 독성 생체 외에서 (개인적인 관찰) 될 수 있는 염증 또는 사용 하는 경우 면역 반응을 일으킬 수 있습니다 vivo에서. 이 문제를 방지, 바이러스 주식 집중 매우 사용 하는 경우에 특히 감염 잠재 정화 하 여 입자 오염에서 분리 해야 합니다.
여러 가지 방법은 정화 및 잠재 벡터10,,1112의 농도 대 한 보고 되었습니다. 사용 가능한 접근의 덤플링을 친화성 크로마토그래피 단백질12오염의 낮은 농도와 정화의 한 단계 높은 수준의 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 잠재13,14에 대 한 수용 체로 heparan 황산 염의 식별을 기반으로 합니다. 열 및 잠재의 바인딩 Sf9 셀 상쾌한 로드, 후 열 생리 (isotonic) 버퍼 언바운드 또는 바운드 느슨하게 오염 입자를 제거 하 세척 될 수 있다. 헤 파 린에 바인딩이 되돌릴 수 있기 때문에, 잠재 입자 삼투성 충격12비활성화를 방지 하기 위해 생리 (isotonic) 소금 농도를 즉시 희석 한 높은 소금 버퍼 eluted 수 있습니다. 또한,에 캡처 뿐만 아니라 잠재, 생산 및 차입 크로마토그래피 열에서 수행할 수 있습니다 현재 좋은 제조 관행 (cGMP)와 호환이 되는 폐쇄 시스템 프로세스를 사용 하 여.
여기, 우리는 제조, 정화, 및 전염 성 잠재 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 원심 분리의 농도 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 짧게, 우리 Sf9 부착 문화에 잠재 플라스 미드 DNA와 세포의 transfection에 의해 잠재를 생산 하 고 혈 청 무료 현 탁 액 문화에서 전염 성 잠재 확장. 우리는 잠재 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 정화 하 고 마지막 단계로 서 ultracentrifugation를 사용 하 여 높은 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 벡터를 집중.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시 된 프로토콜 Sf9 셀 서 스 펜 션 문화에 잠재의 생산과 덤플링을 친화성 크로마토그래피를 사용 하 여 잠재의 정화에 설명 합니다. 이 프로토콜에 사용 되는 매개 변수 수익률을 극대화 하 고 잠재 감염의 비활성화를 최소화 합니다. 여기에 제공 된 프로토콜 표시 복구에 비해 잠재 입자의 크게 향상 된 복구는9다른 사람에 의해 달성 됩니다.
때문?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 시작 자금 신시내티 어린이 연구 재단 (CCRF)에서 M.N. 및 혁신적인 코어 그랜트 (ICG)에서 국립 보건원의 변환 과학 발전을 위한 국가 센터에 의해 지원에 의해 부분적으로 지원 보너스 번호 UL1 TR001425입니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
