Produktion og oprensning af Baculovirus for genterapi ansøgning
Summary
I denne protokol, er baculovirus produceret af forbigående Transfektion af baculovirus plasmid i Sf9 celler og forstærket i et serumfrit suspension kultur. Supernatanten er renset af heparin affinitet kromatografi og yderligere koncentreret af ultracentrifugering. Denne protokol er nyttigt for produktion og oprensning af baculovirus for gen terapi program.
Abstract
Baculovirus har traditionelt været brugt til fremstilling af rekombinante protein og vaccine. Men mere for nylig, baculovirus fremstår som en lovende vektor for gen terapi program. Her, er baculovirus produceret af forbigående Transfektion af baculovirus plasmid DNA (bacmid) i en vedhængende kultur af Sf9 celler. Baculovirus er senere udvidet i Sf9 celler i et serumfrit suspension kultur, indtil den ønskede rumfang er opnået. Det er derefter renset fra kultur supernatanten ved hjælp af heparin affinitet kromatografi. Virus supernatanten er lastet på kolonnen heparin, som binder baculovirus partikler i supernatanten på grund af affinitet af heparin for baculovirus indhylle glycoprotein. Kolonnen er vasket med en buffer til at fjerne forurenende stoffer og baculovirus elueres af kolonnen med en høj-salt buffer. Eluatet er fortyndet til en isotonisk saltkoncentration og baculovirus partikler er yderligere koncentreret ved hjælp af ultracentrifugering. Du bruger denne metode, kan baculovirus være koncentreret op til 500-fold med en 25% genanvendelse af smitsomme partikler. Selv om protokollen beskrevet her viser produktion og rensning af baculovirus fra kulturer op til 1 L, metoden kan være skaleres op i et lukket system suspension kultur til at producere en klinisk-grade vektor for gen terapi program.
Introduction
Baculovirus bruges primært til produktion af rekombinante proteiner og vacciner i lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9 insekt celler ved hjælp af rekombinante Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosevirus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. for nylig, det er ved at opstå som en lovende vektor for gene therapy program5. Det er kendt for at have en bred vært og væv tropisme, inficerer inaktiv og prolifererende celler, er ikke-patogene og integrere ikke vært kromosom4,5,6. Derudover kan baculovirus fremstilles i serumfrit suspension kultur, som er skalerbar og giver mulighed for lukket system behandling for fremtidige kliniske produktion1.
Renheden af baculovirus partikler er vigtig for at opnå effektiv transduktion samtidig minimere cytotoksicitet7,8,9. Baculovirus kan være koncentreret af ultracentrifugering eller tangential flow filtrering (TFF) med begrænset indvirkning på dens smitteevne. Disse procedurer ikke kun koncentrere viruspartikler men også celleaffald og proteiner fra Sf9 kultur, som kan være giftige i vitro (personlige observation) og kan fremkalde betændelse eller en immunrespons, når de anvendes i vivo. For at undgå dette, især når ved hjælp af stærkt koncentreret viruslagrene, skal smitsomme baculovirus være renset og adskilt fra forurener partikler.
Flere metoder er blevet rapporteret til rensning og koncentration af baculovirus vektorer10,11,12. Af de tilgængelige metoder, heparin affinitet kromatografi giver mulighed for en trinvis højt niveau af rensning med den lave koncentration af forurenende proteiner12. Metoden er baseret på identificering af heparan sulfat som receptoren for baculovirus13,14. Efter indlæsning Sf9 celle supernatanten over på kolonnen og binding af baculovirus, kan kolonnen vaskes med fysiologisk (isotonisk) buffer til at fjerne ubundne eller løst bundet forurenende partikler. Da binding til heparin er reversible, kan baculovirus partikler elueret med et højt salt buffer, som er fortyndet straks til fysiologisk (isotonisk) salt koncentration at forhindre inaktivering af osmotisk chok12. Derudover kan produktion af baculovirus, såvel som opsamling på og eluering fra kolonnen kromatografi udføres ved hjælp af et lukket system proces, der er kompatible med aktuelle god fremstillingspraksis (cGMP).
Her give vi en detaljeret protokol til fremstilling, rensning og koncentration af smitsomme baculovirus ved hjælp af affinitet kromatografi og centrifugering. Kort, vi producere baculovirus af Transfektion af Sf9 celler med en baculovirus plasmid DNA i vedhængende kultur og yderligere udvide den smitsomme baculovirus i serumfrit suspension kultur. Vi rense baculovirus ved hjælp af heparin affinitet kromatografi og bruge ultracentrifugering som det sidste trin meget koncentrere vektor for gen terapi program.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen præsenteres her beskriver produktion af baculovirus i Sf9 celler i suspension kultur og rensning af baculovirus ved hjælp af en heparin affinitet kromatografi. De parametre, der anvendes i denne protokol maksimere udbyttet og minimere inaktivering af smitsomme baculovirus. Protokollen i henhold her viser et betydeligt bedre inddrivelse af baculovirus partikler i forhold til inddrivelse af andre9.
På grund af bred host range og væv tropisme, blev flere un…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er delvist understøttet af Start-Up finansieringen fra Cincinnati children’s Research Foundation (CCRF) til M.N. og Innovative Core Grant (regeringskonferencen) støttet af National Center for fremme translationel videnskab af National Institutes of Health under Award nummer UL1 TR001425. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
