Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

Summary

Nous présentons ici un protocole pour montrer comment cellule photoconversion est réalisée grâce à l’exposition aux UV dans des zones spécifiques exprimant la protéine fluorescente, Eos, chez les individus vivants.

Abstract

Des tissus animaux et végétaux sont composée de populations distinctes de cellules. Ces cellules interagissent au fil du temps pour bâtir et maintenir les tissus et peuvent provoquer des maladies lorsque perturbés. Les scientifiques ont développé des techniques intelligents afin d’étudier les caractéristiques et la dynamique naturelle de ces cellules dans les tissus intacts en exprimant des protéines fluorescentes en sous-ensembles de cellules. Toutefois, à certains moments, expériences nécessitent plus sélectionnée visualisation des cellules dans les tissus, parfois à la manière monocellulaires ou population-de-cells. Pour atteindre cet objectif et visualiser les cellules individuelles au sein d’une population de cellules, les scientifiques ont utilisé unicellulaires photoconversion de protéines fluorescentes. Pour illustrer cette technique, nous montrons ici comment diriger la lumière UV à une cellule exprimant l’Eos d’intérêt dans un état intact, vit le poisson-zèbre. Nous avons ensuite image ces cellules de Eos⁺ photoconverted 24 h plus tard pour déterminer comment ils ont changé dans le tissu. Nous décrivons deux techniques : simple cellule photoconversion et photoconversions des populations de cellules. Ces techniques permettent de visualiser les interactions cellule-cellule, cellule-destin et différenciation et les migrations cellulaires, ce qui en fait une technique qui s’applique à nombreuses questions biologiques.

Introduction

Plusieurs cellules distinctes interagissent pour construire et entretenir des tissus animaux et végétaux complexes. Ces cellules sont souvent intercalés et difficiles à distinguer des voisins au niveau unicellulaire sans microscopie haute résolution qui nécessitent la fixation du tissu. Cependant, pour comprendre comment ces forment les tissus, sont maintenus et deviennent malades, il a été essentiel pour étudier comment simple cellules dans les tissus sont en interaction avec le temps. Idéalement, ces expériences exigent l’étiquetage des cellules individuelles au sein d’un tissu, d’une manière non invasive sans l’exigence de fixation. Les scientifiques ont maintenant....

Protocol

Toutes les études animales ont été approuvés par l’Université de Notre Dame institutionnels et animalier Comité d’urbanisme.

1. préparation de l’éprouvette de poisson-zèbre

1. Placez un mâle adulte et un adulte femelle Tg (protéine convertible) dans une chambre accouplement par procédures standard¹³. Dans ce manuscrit, utilisez Tg(sox10:eos) poisson⁹ en raison de l’accès mais autres lignées transgéniques avec les protéines et peut être utilisée indifféremment. Mis en place plus d’une chambre dans le cas où ne pas placer de poissons. Laissez le poisson à rester dans la salle pendant la n....

Results

Photoconversion de protéines fluorescentes peut être utilisée pour étiqueter des cellules distinctes au sein d’un tissu⁶. Pour illustrer cela, Tg(sox10:eos) poisson⁹ ont été utilisés pour exprimer la protéine et Eos sous les séquences régulatrices de sox10. Les animaux Tg(sox10:eos) à 48 hpf ont monté tout d’abord et ensuite imagés pour détecter n’importe quel photoconversion non spécifique qui peut avoir eu lieu. .......

Discussion

Dans les tissus complexes, différents types de cellules organisent dans des domaines spécifiques. Récemment, des techniques ont été utilisées pour marquer les cellules individuelles au sein de ces tissus de grandes structures^1,2,3. Nous démontrons ici deux techniques qui peuvent de même être utilisées pour visualiser les interactions cellulaires unique et interactions entre population de cellules dans les tissus complexes. L’ava.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tg(sox10 :eos) animaux de poisson-zèbre			Des poissons ont été obtenus et croisés à partir de l’installation de poissons de l’Université de Notre Dame
100 X 15 mm boîte de Pétri	VWR	25384-302
Embryon medium			Un milieu embryonnaire est fabriqué chaque semaine et fourni par l’installation de gestion du poisson de l’Université de Notre Dame, contenant 5 litres d’eau osmosée, 30 μL de bleu de méthylène et 200 ml de stock de sel.
0,8 % à faible point de fusion Agarose	dot scientific inc	9012-36-6
Boîte de Pétri à fond de lamelle en verre de 35 X 10 mm	Ted Pella Inc.	14021-20
			de dissection à l’aiguille
0,002 % ester d’acide 3-aminobenzoïque (Tricaïne)	Fluka analytique	A5040-250G
Microscope de dissection fluorescent avec filtres GFP	Zeiss Axiozoom
Microscope confocal avec lasers pour exciter les jeux de filtres GFP et RFP	3i disque rotatif confocal
Source de lumière UV (laser) pour photoconversion			405 nm
Logiciel de diaporama	3i
Bleu de méthylène	Kordon