تصور أكتين وسيتوسكيليتونس ميكروتوبولي في المشبك محصنة خلية ب استخدام الفحص المجهري استنفاد (STED) حفز الانبعاثات
Summary
نقدم بروتوكول لاستخدام الفحص المجهري STED في نفس الوقت الصورة أكتين الهياكل وميكروتوبوليس، والبروتينات ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية الملزمة في الخلايا ب التي انتشرت في كوفيرسليبس المغلفة بالأجسام المضادة لمستقبلات الخلية ب، ونموذج للمرحلة الأولى تشكيل المشبك محصنة.
Abstract
ب الخلايا التي تربط المستضدات غشاء محدد (مثلاً، على سطح خلية عرض مستضد) تشكيل المشبك منأى، بنية خلوية متخصصة التي يحسن إشارات مستقبلات (المركز) ب-الخلية واقتناء مستضد المركز بوساطة. كلا يعيد البناء cytoskeleton أكتين وإعادة توجيه الشبكة microtubule نحو الموقع الاتصال مستضد ضرورية لتشكيل المشبك محصنة. يعيد البناء من cytoskeleton أكتين في حلقة المحيطية كثيفة من أكتين و يرافق الاستقطاب مركز تنظيم microtubule نحو المشبك محصنة. البروتينات ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية الملزمة، فضلا عن البروتينات القشرية نهاية بالإضافة إلى التقاط التوسط التفاعلات الفيزيائية بين سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي، التي تسمح لهم بإعادة تنظيمها بطريقة منسقة. توضيح آليات أن تحكم عملية إعادة التنظيم هذه سيتوسكيليتال، فضلا عن فهم كيف أن هذه الهياكل cytoskeletal تشكيل تشكيل المشبك محصنة ويشير إلى المركز، يمكن أن توفر أفكاراً جديدة في تنشيط الخلية ب. وهذا قد ساعد بوضع نهج مجهرية فائقة القرار التي تكشف عن تفاصيل جديدة عن شبكة سيتوسكيليتال المنظمة. يصف لنا هنا طريقة لاستخدام الميكروسكوب استنفاد (STED) حفز الانبعاثات في نفس الوقت الصورة أكتين الهياكل وميكروتوبوليس، والبروتينات transfected microtubule معلم بروتينات فلورية خضراء بالإضافة إلى نهاية الملزمة في الخلايا باء. نموذج الأحداث المبكرة في تشكيل المشبك محصنة، نسمح للخلايا ب ينتشر في كوفيرسليبس المغلفة مع الغلوبولين المناعي المضادة (مكافحة-Ig) الأجسام المضادة، التي تبدأ إشارات المركز وإعادة عرض cytoskeleton. نحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة للتعبير عن التجارة والنقل الانصهار البروتينات في الخلايا A20 ب-سرطان الغدد اللمفاوية للخلية التي يسببها Ig مكافحة انتشار وتثبيت الخلية اللاحقة وإيمونوستاينينج، والحصول على الصور والخطوات deconvolution صورة. الصور عالية الدقة التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الإجراءات تسمح بتصور في نفس الوقت هياكل أكتين وميكروتوبوليس والبروتينات بالإضافة إلى نهاية الملزمة microtubule التي قد تربط هذه الشبكات سيتوسكيليتال اثنين.
Introduction
عند ربط الخلايا ب الاستقطاب صفائف مستضدات (مثلاً، عرض على سطح عرض مستضد الخلايا (Apc))، مستقبلات ب-الخلية الناتجة (المركز) مما يشير إلى تشكيل بنية المشبك محصنة ضد الكلاسيكية، الذي كان أول وصف في محركات الأقراص تي الخلايا1،2،3،4،5،6،،من78،9،10، 11،،من1213. في البداية، ميكروكلوستيرس نموذج بكرس مستضد زمنياً في المحيط الموقع الاتصال ب الخلية: آسيا والمحيط الهادئ. ثم نقل هذه ميكروكلوستيرس نحو مركز الموقع مستضد الاتصال، حيث أنهم بلورتها في تنشيط supramolecular وسط كتلة (كسماك) الذي يشكل جوهر المشبك محصنة. يحسن المركز مما يشير إلى تشكيل المشبك محصنة ويسهل استخراج مستضد المركز بوساطة من الغشاء APC14. يسمح هذا الاستحواذ مستضد، التي تبعتها مستضد المركز بوساطة التدخيل وتجهيز مستضد اللاحقة، خلايا ب تقديم الببتيد: MHC المجمعات الثاني لخلايا تي، والتماس مساعدة خلية T14. ونظرا لأن يعزز تشكيل المشبك محصنة تنشيط الخلية ب، توضيح الآليات التي تنشئ يمكن توفير هذا النمط الوظيفي للمنظمة مستقبلات جديدة ثاقبة الاستجابات المناعية خلطيه كيف بدأت تنظم.
إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي على السواء أمر ضروري لتشكيل المشبك محصنة. يدفع المركز مترجمة إشارات تحفزها مجموعة الأقطاب مكانياً من مولدات المضادات سريعة ودرامية يعيد البناء من1،سيتوسكيليتون أكتين15. تشكيل هياكل أكتين الجذعية في محيط الخلية بتمارس قوي دفع في غشاء البلازما ويعزز نشر الخلية ب. هذا يسمح للخلية بالي مسح مساحة أكبر من سطح مستضد الحاملة، ويزيد عدد بكرس التي تربط المستضد وتنشيط المركز مما يشير إلى مسارات. في الوقت نفسه، بعد وشبكة ميكروتوبولي بتوجيه نحو موقع الاتصال مستضد. مع اقتراب بعد الموقع الاتصال مستضد، microtubules المنبثقة عن بعد تمتد على طول الوجه الداخلي لغشاء البلازما في مجال التفاعل بين الخلية ب و تحمل مستضد السطح16،17. ثم يمكن أن تعمل هذه ميكروتوبوليس جوكستاميمبراني كمسارات للحركة المركزي دينين بوساطة مستضد زمنياً بنك ميكروكلوستيرس18، مما يؤدي إلى تشكيل كسماك.
إعادة توجيه والاستقطاب من بعد نحو المشبك المناعي يتطلب أكتين سليمة وسيتوسكيليتونس ميكروتوبولي، وغالباً ما يعتمد على التفاعل بين الأكتين القشرية الشبكة وميكروتوبوليس16،17، ،من 1920. يمكن التقاط القشرية البروتينات أكتين-ملزمة، مثل IQGAP1، ميكروتوبوليس من خلال التفاعل مع البروتين المجمعات التي تزين نهايات الجمع microtubule21. وتشمل هذه المجمعات الحيوية للبروتينات بالإضافة إلى نهاية الملزمة EB1 ومقطع-170، التي يشار إليها مجتمعة وصفه ميكروتوبولي بالإضافة إلى نهاية تتبع البروتينات (+ نصائح)21،22. + يمكن ربط نصائح في نهايات microtubules البروتينات المرتبطة بغشاء البلازما أو cytoskeleton أكتين القشرية. هذا يسمح لآليات توليد القوة (مثلاً، الناقص-النهاية توجيه حركة دينين كورتيكالي ترتكز على طول microtubules) بذل سحب القوات في ميكروتوبوليس ومن ثم تغيير موضع بعد. ربط البروتين السقالات المرتبطة أكتين IQGAP123قصاصة-170، وقد أظهرنا أن كلا من هذه البروتينات مطلوبة من أجل الاستقطاب الناجم عن المركز بعد نحو المشبك محصنة ضد17. هذا التفاعل IQGAP1-القصاصة-170 قد تلعب دوراً رئيسيا في تنسيق إعادة عرض cytoskeleton الأكتين مع إعادة تنظيم شبكة microtubule في المشبك محصنة ب-الخلية.
وكشفت مجهرية الفلورية التقليدية المثيرة إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين و microtubule أثناء تشكيل المشبك محصنة خلية ب2. ومع ذلك، لا يمكن حل هذا النهج الهياكل الخلوية الصغيرة بالتفصيل بسبب الحد حيود الضوء، الذي، وفقا للقانون لأبي، ويعتمد على الطول الموجي للضوء المستخدمة لإلقاء الضوء على العينة وفتحه موضوعية24. يقيد هذا الحد حيود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية إلى 200-300 نانومتر في الاتجاه الأفقي و 500-700 نانومتر في اتجاه محوري25. ولذلك، سوبسيلولار هياكل أصغر حجماً، فضلا عن التفاصيل الدقيقة سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي، يمكن فقط ملاحظة باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني. التصوير بالميكروسكوب الإلكتروني سيتوسكيليتون هو مضيعة للوقت، ويتطلب عينة قاسية وتثبيت وإعداد البروتوكولات التي يمكن أن تغير الهياكل البيولوجية، ويقتصر على الكشف عن الأجسام المضادة بوساطة. القدرة على إيمونوستاين وفي نفس الوقت صورة بروتينات متعددة أو الهياكل الخلوية ميزة كبيرة للفحص المجهري الأسفار. وعلاوة على ذلك، معربا عن البروتينات الفلورية الانصهار في الخلايا يتيح التصوير في الوقت الحقيقي ومفيد عندما لا تتوفر الأجسام المضادة الفعالة ل immunostaining بروتين الفائدة.
الأخيرة التقدم التكنولوجي في مجال مجهرية فائقة القرار التغلب على حدود حيود الضوء والسماح لهم التصور من النانو الهياكل الخلوية24. مثل أسلوب مجهرية فائقة القرار واحد يسمى مجهرية استنفاد (STED) حفز الانبعاثات. وتوظف STED اثنين من أشعة الليزر، حيث ليزر واحد يثير في فلوروفوري وليزر ثانية مع نقش على شكل دونات بشكل انتقائي يمنع انبعاث fluorescence حولها فلوروفوري. هذا يقلل من انتشار نقطة الدالة (منطقة الظاهرة) من الجسيمات الفلورية واحد ويوفر حيود الفرعية حد صورة فلورسنت25،26. كما تستخدم استنزاف الأرض-دولة مجهرية التقنيات المستندة إلى الأسفار للحصول على صور فائقة الدقة. ومع ذلك، مرات اقتناء والتعمير في الصورة طويلة وهناك عدد محدود فقط من فلوروفوريس التي يمكن استخدامها والتصوير عالي الدقة المتزامنة من عدة مكونات cytoskeletal يمثل تحديا تقنيا للحفاظ على هياكل أكتين و microtubule يتطلب إجراءات مختلفة من التثبيت. ولذلك، STED مزايا متعددة أكثر من المجهر الإلكتروني ونهج أخرى مجهرية فائقة القرار حيث أنه يوفر الحصول على الصور السريعة، ولديه الحد الأدنى من متطلبات تجهيز، وتوظف فلوروفوريس نفسه وتلطيخ تقنيات التي يتم استخدامها الفلورية التقليدية الفحص المجهري لعينات ثابت26.
الآن وقد استخدم مجهرية فائقة القرار لتصور الهياكل أكتين على المشبك المناعي في الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعي وتي الخلايا26،27،،من2829،30، 31-بيد تصوير القرار فائقة من سيتوسكيليتون ميكروتوبولي، وكذلك تنسيق إعادة تنظيم سيتوسكيليتونس أكتين و microtubule أثناء تشكيل المشبك المناعية، إلا في الآونة الأخيرة عنها17. كنا مجهرية STED الصورة ب الخلايا التي كان قد سمح لتنتشر في كوفيرسليبس المغلفة مع الغلوبولين المناعي المضادة (مكافحة-Ig) الأجسام المضادة، مما حفز المركز الإشارات والشروع في عملية إعادة التنظيم cytoskeleton. عندما مطلي على الأجسام المضادة-Ig المعطل تداولها، خلايا ب الخضوع درامية أكتين-تعتمد على الانتشار، الذي يلخص الأحداث الأولى أثناء تشكيل المشبك محصنة. الأهم من ذلك، الفحص المجهري STED كشف التفاصيل الدقيقة لعصابة الجذعية من أكتين و أشكال في المحيط المناعة المشبك وأظهرت أن بعد، فضلا عن microtubules المرتبطة به، قد انتقلت قريبة من موقع الاتصال مستضد17. هذه microtubules الموسعة إلى الخارج نحو الحلقة المحيطية من أكتين و. وعلاوة على ذلك، تصوير STED متعدد الألوان من توليفات مختلفة من F-أكتين، توبولين، IQGAP1، ومعلم بروتينات فلورية خضراء مقطع-170 + نصائح بينت أن microtubule زائد-ينتهي تميزت CLIP-170-التجارة والنقل ارتباطاً وثيقا مع meshwork أكتين الطرفية، ومع IQGAP1، التقاط القشرية البروتين17.
نقدم هنا، بروتوكول مفصل للتصوير سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي في المشبك محصنة ضد استخدام الفحص المجهري STED. وقد تم تحسين هذه الأساليب باستخدام الخط مورين بالخليه A20، والتي استخدمت على نطاق واسع لدراسة المركز الإشارات والمشبك محصنة ضد تشكيل17،،من3233،،من3435 , 36 , 37 , 38 , 39-نظراً لأن الأجسام المضادة التجارية إلى القصاصة-170 لا تعمل جيدا بالنسبة إيمونوستاينينج في التجارب السابقة، يصف لنا بالتفصيل التعبير عن معلم بروتينات فلورية خضراء مقطع-170 في الخلايا A20، جنبا إلى جنب مع تلطيخ البروتوكولات لتصور في نفس الوقت تصل إلى ثلاثة مكونات cytoskeletal أو البروتينات المرتبطة سيتوسكيليتون. أساليب لاستخدام STED المجهري للصورة أكتين في ناغورني كاراباخ الخلايا المناعية نهايات منذ الموصوفة سابقا40. هنا، نحن تمديد هذا للحصول على صور متعددة الألوان فائقة القرار سيتوسكيليتونس أكتين وميكروتوبولي على السواء في الخلايا ب.
يتم استخدام أحد الاعتبارات الهامة مجهرية فائقة القرار إجراءات التثبيت المناسبة للحفاظ على الهياكل الخلوية ومنع الأضرار بالبروتينات الفلورية. لقد تم تحسين التثبيت وتلطيخ الأساليب المقدمة في هذه الوثيقة الاحتفاظ بالأسفار التجارة والنقل وتوفير تصوير عالي الدقة من شبكات أكتين وميكروتوبولي. عند التعبير عن البروتينات الفلورية، تجدر الإشارة إلى أن الخلايا ب يصعب عادة ترانسفيكت. استخدام هذا البروتوكول، 20-50% من A20 يعرب الخلايا عادة البروتين فيوجن التجارة والنقل ترانسفيكتيد وبين هذه الفئة من السكان هي مستويات البروتين التعبير المتغير. ومع ذلك، تصوير فائقة القرار أكتين وميكروتوبوليس باستخدام الإجراءات التي يمكننا وصف قوية جداً وهي سهولة الحصول على صور عالية الجودة. وعلى الرغم من صغر حجمها بالنسبة إلى الخلايا A20، نظهر أن هذه الإجراءات يمكن أيضا استخدامها لصورة الشبكة ميكروتوبولي في الخلايا ب الأولية التي قد تم تفعيلها بإيجاز مع lipopolysaccharide (LPS). وقد أظهرنا أن لبس تنشيط الخلايا ب الابتدائي يمكن تكون transfected مع سيرناس في كفاءة عالية نسبيا (أي، مثل أن نضوب البروتين يمكن الكشف عنها بواسطة immunoblotting)، يجعلها بديلاً جيدا لاستخدام خطوط الخلايا ب لبعض الدراسات 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن الحصول على صور مفصلة للهياكل سيتوسكيليتال باستخدام مجهرية فائقة القرار STED، الذي يمكن نظرياً أن التوصل إلى قرار 50 نانومتر، مقارنة بالفحص المجهري [كنفوكل] التقليدية، الذي هو قرار حيود محدودة ~ 200 nm 24-كما تم تعزيز القدرة على حل الهياكل الدقيقة باستخدام البرمجيات deconvolution لحس?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر “مرفق التصوير معهد علوم الحياة جامعة كولومبيا البريطانية” (LSI) لدعم وصيانة المجهر STED. تم تمويل هذا العمل بمنحه #68865 من “المعاهد الكندية للبحوث الصحية” (M.R.G.). ونشكر الدكتور كوزو كايبوتشي (جامعة ناغويا، ناغويا، اليابان) على بلازميد CLIP-170-التجارة والنقل.
Materials
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
- Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
- Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
- Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
- Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
- Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
- Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
- Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
- Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
- Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
- Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
- Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
- Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
- Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
- Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
- Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
- Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
- Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
- Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
- McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
- Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
- Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
- Yuseff, M. -. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Russ, J. C. . The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).
- Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
- Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
