JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

להמחיש את אקטין ואת Microtubule Cytoskeletons על הסינפסה B-cell המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ דלדול (STED) פליטה מאולצת

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57028
, ,
1Department of Microbiology and Immunology,University of British Columbia

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות מיקרוסקופ STED בו-זמנית תמונה אקטין מבנים, microtubules של microtubule פלוס-end מחייב חלבונים בתאי B שהופצו על coverslips מצופה נוגדנים לקולטן B-cell, מודל עבור השלב הראשוני היווצרות מערכת החיסון סינפסה.

Abstract

תאי B לאגד ממברנה מכורך אנטיגנים (למשל, על פני השטח של תא אנטיגן) יוצרים סינפסה על המערכת החיסונית, מבנה הסלולר מיוחדים אשר מייעל B-cell קולטן (BCR) איתות ורכישה בתיווך BCR אנטיגן. שני את הבנייה מחדש של שלד התא של אקטין, את ולהתפכחות של הרשת microtubule כלפי האתר קשר אנטיגן חיוניים עבור המערכת החיסונית סינפסה היווצרות. שיפוץ של שלד התא אקטין לתוך טבעת היקפית צפופה של F-אקטין מלווה קיטוב של מרכז ארגון microtubule לכיוון הסינפסה המערכת החיסונית. Microtubule פלוס-end מחייב חלבונים, וכן לכידת פלוס-end קורטיקלית חלבונים מתווכים האינטראקציות פיזי בין cytoskeletons אקטין, microtubule, המאפשרים להם יהיו מאורגנות באופן מתואם. שחקרתי את מנגנוני הבקרה הארגון מחדש cytoskeletal, כמו גם הבנה איך אלה מבנים cytoskeletal לעצב מערכת החיסון סינפסה היווצרות והאיתות BCR, יכול לספק תובנות חדשות תא B הפעלה. זה נעזר בגילויים הפיתוח של גישות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר חושפים פרטים חדשים cytoskeletal רשת הארגון. נתאר כאן שיטה באמצעות פליטה מאולצת מיקרוסקופ דלדול (STED) בו זמנית תמונה אקטין מבנים, microtubules של transfected microtubule מתויג GFP פלוס-end מחייב חלבונים בתאי B. המודל האירועים בתחילת במבנה המערכת החיסונית סינפסה, אנו מאפשרים בתאי B למרוח אותו על coverslips מצופים נוגדן אנטי (anti-Ig) נוגדנים, ליזום BCR איתות ובניה שלד התא. אנו מספקים פרוטוקולים צעד אחר צעד לביטוי GFP פיוז’ן חלבונים בתאים A20 B-לימפומה, להפצת תא אנטי-Ig-induced, קיבוע תא עוקבות, Immunostaining, ייבוא תמונות של התמונה deconvolution צעדים. התמונות ברזולוציה גבוהה מושגת באמצעות הליכים אלה מאפשרים אחד בו זמנית להמחיש אקטין מבנים microtubules, החלבונים פלוס-קצה הכריכה microtubule עשויים לקשר אלה שתי רשתות cytoskeletal.

Introduction

כאשר תאים B לאגד מקוטב מערכים של אנטיגנים (למשל, המוצג על פני השטח של אנטיגן תאים (נגמ שים)), וכתוצאה מכך B-cell הקולטן (BCR) איתות כוננים היווצרות של מבנה קלאסי סינפסה המערכת החיסונית, אשר היה הראשון המתואר T תאים1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. בתחילה, microclusters בצורה BCRs אנטיגן מכורך בפריפריה של התא B: APC פנה אל האתר. אלה microclusters לאחר מכן להזיז לכיוון המרכז של האתר קשר אנטיגן, איפה הם מזג לתוך אשכול מרכזי ההפעלה סופרא מולקולרית (cSMAC) המהווה הליבה של הסינפסה המערכת החיסונית. סינפסה המערכת החיסונית היווצרות מייעל BCR איתות ומקל אנטיגן בתיווך BCR החילוץ של קרום APC14. רכישה זו אנטיגן, שבעקבותיה באה אנטיגן בתיווך BCR הפנמה ועיבוד אנטיגן עוקבות, מאפשר תאי B להציג פפטיד: MHC II מתחמי לתאי T וירתקו את תא T עזרה14. כי המערכת החיסונית סינפסה היווצרות מקדם תא B הפעלה, שחקרתי את המנגנונים המקימים שזה דפוס פונקציונלי של קולטן הארגון יכול לספק חדש תובנות תגובות חיסוניות ההורמונאלית איך יזם, מוסדר.

ארגון מחדש של אקטין והן microtubule cytoskeletons חיוני עבור המערכת החיסונית סינפסה היווצרות. BCR מקומי איתות מגורה על ידי מערך מקוטב במרחב של אנטיגנים גורם מהירה ודרמטית שיפוץ של אקטין שלד התא1,15. היווצרות של אקטין דנדריטים מבנים בפריפריה של תא B מפעילה כוחות לדחוף על קרום פלזמה ומקדם תא B הפצת. זה מאפשר התא B לסרוק אזור רחב יותר מניבי אנטיגן פני השטח, מגדילה את מספר BCRs אשר מאגד אנטיגן ולהפעיל BCR מסלולי איתות. במקביל, MTOC את הרשת microtubule הם reoriented כלפי האתר של אנטיגן קשר. MTOC מתקרב האתר קשר אנטיגן, microtubules שמקורם MTOC להאריך לאורך הפנים הפנימי של קרום פלזמה על הממשק בין התא B לבין משטח אנטיגן מניבי16,ה-17. Microtubules juxtamembrane אלה יכולים לשמש ואז רצועות עבור תנועת צנטריפטלי בתיווך דינאין של אנטיגן מכורך BCR microclusters18, שמוביל היווצרות cSMAC.

ולהתפכחות קיטוב של MTOC לכיוון הסינפסה המערכת החיסונית דורש אקטין שלם microtubule cytoskeletons ואת תלויים אינטראקציות בין אקטין קורטיקלית microtubules ורשת16,17, 19,20. החלבונים אקטין-איגוד בקליפת המוח, כגון IQGAP1, באפשרותך ללכוד microtubules על ידי אינטראקציה עם מתחמי חלבון המעטרים את קצות פלוס microtubule21. אלה מתחמי דינמי של פלוס-end מחייב חלבונים כוללים EB1, סרטון-170, אשר מתייחסים באופן קולקטיבי בתור microtubule פלוס-סוף מעקב חלבונים (+ טיפים)21,22. + טיפים בקצות microtubules ניתן לאגד חלבונים המקושרים עם קרום פלזמה או את שלד התא אקטין קורטיקלית. זה מאפשר מנגנונים ליצירת כוח (למשלהמינוס-הסוף ביים תנועת מעוגן cortically דינאין לאורך microtubules) כדי להפעיל כוחות מושך-microtubules, ובכך למקם מחדש את MTOC. קליפ-170 ניתן לאגד החלבון אקטין-הקשורים פיגומים IQGAP123, הראינו כי שני חלבונים אלה נדרשים עבור MTOC BCR-induced קיטוב לכיוון ה17-סינפסה המערכת החיסונית. אינטראקציה זו IQGAP1-קליפ-170 עשוי לשחק תפקיד מפתח בתיאום את הבנייה מחדש של שלד התא אקטין עם מיקום מחדש של הרשת microtubule על הסינפסה המערכת החיסונית B-cell.

קרינה פלואורסצנטית קונבנציונאלי מיקרוסקופ חשף דרמטי לארגונו מחדש של cytoskeletons אקטין, microtubule במהלך B-cell סינפסה המערכת החיסונית היווצרות2. עם זאת, גישה זו אין אפשרות לפענח קטן מבנים הסלולר בפירוט עקב המגבלה עקיפה של אור, אשר, על פי החוק של אבה, היא תלויה אורך הגל של האור בשימוש כדי להאיר את הדגימה, את הצמצם של אובייקטיביות24. מגבלה זו עקיפה מאלץ את הרזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי 200-300 ננומטר בכיוון לרוחב, 500-700 nm, כיוון צירית25. לכן, subcellular מבנים קטנים יותר, כמו גם את הפרטים הקטנים של אקטין, microtubule cytoskeletons, יכול רק להיות שנצפו באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים. מיקרוסקופ אלקטרונים הדמיה של שלד התא הוא זמן רב, דורש דגימה קשים קיבוע והכנות פרוטוקולים יכול לשנות מבנים ביולוגיים, ולא מוגבל לאיתור בתיווך נוגדנים. היכולת immunostain, בו זמנית תמונה מספר חלבונים או מבנים הסלולר הוא יתרון משמעותי של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. יתר על כן, ביטוי פיוז’ן פלורסנט חלבונים בתאים מאפשר הדמיה בזמן אמת והוא שימושי כאשר נוגדנים יעילים עבור immunostaining החלבון עניין אינם זמינים.

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות במיקרוסקופ ברזולוציה סופר יש להתגבר על המגבלות עקיפה של אור והתירו את החזיית ננו-מבנים הסלולר24. אחד טכניקה מיקרוסקופית רזולוציה סופר כזה נקרא פליטה מאולצת מיקרוסקופ דלדול (STED). STED מעסיקה שני לייזרים, לייזר אחד מגרה את fluorophore ואיפה לייזר השני עם תבנית בצורת סופגנייה מעלימה באופן סלקטיבי את פליטת קרינה פלואורסצנטית סביב fluorophore. זה מפחית את פונקציית נקודת-התפשטות (אזור לכאורה) של חלקיק בודד פלורסנט ומספק25,26תמונות פלורסנט מגבלת עקיפה המשנה. מיקרוסקופ דלדול הקרקע-המדינה מעסיקה גם טכניקות מבוססות קרינה פלואורסצנטית לרכוש תמונות ברזולוציה-העל. עם זאת, התמונה רכישה ושחזור הפעמים ארוכות ישנם רק מספר מוגבל של fluorophores יכול לשמש, ההדמיה ברזולוציה גבוהה בו זמנית של מספר רכיבים cytoskeletal הוא טכנית מאתגר כי שמירה אקטין ומבני microtubule דורש הליכים קיבוע שונות. לכן, STED יש מספר יתרונות על פני מיקרוסקופ אלקטרונים, אחרים מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה גישות בכך שזה מציע ייבוא תמונות מהיר, יש דרישות מינימליות עיבוד דפוס, מעסיקה את fluorophores אותו והוא מכתים טכניקות זה משמשים פלורסצנטיות קונבנציונאלי מיקרוסקופיה של דגימות קבוע26.

מיקרוסקופ ברזולוציה סופר עכשיו נעשה שימוש כדי להמחיש אקטין מבנים ב הסינפסה מחוסן טבעית תאים (NK) רוצח ו T תאים26,27,28,29,30, 31. אולם, הדמיה ברזולוציה-העל של שלד התא microtubule, כמו גם מתואמת לארגונו מחדש של cytoskeletons אקטין, microtubule במהלך היווצרות סינפסה המערכת החיסונית, רק באחרונה דווח על17. השתמשנו STED במיקרוסקופ בתאים תמונה B שלא היו נותנים למרוח אותו על coverslips מצופים נוגדן אנטי (anti-Ig) נוגדנים, BCR איתות וליזום רה-ארגון שלד התא. כאשר מצופה על קיבוע נוגדנים anti-Ig, בתאי B עוברים דרמטי תלויי-אקטין המריחה, אשר recapitulates את האירועים הראשונית במהלך היווצרות מערכת החיסון סינפסה. חשוב לציין, מיקרוסקופ STED חשף את הפרטים הקטנים של הטבעת דנדריטים של F-אקטין סינפסה צורות בפריפריה של מערכת החיסון, הראה כי את MTOC, כמו גם את microtubules המצורף אליו, עברה ליד האתר קשר אנטיגן17. אלה microtubules מורחב החוצה לכיוון הטבעת ההיקפית של F-אקטין. יתר על כן, ההדמיה STED צבע רב של שילובים שונים של F-אקטין, טובולין, IQGAP1, ו מתויג GFP קליפ-170 + טיפים הראתה כי microtubule פלוס-מסתיים בסימן קליפ-170-GFP היו קשורים באופן הדוק meshwork של אקטין היקפיים, עם IQGAP1, לכידת קורטיקלית חלבון17.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט הדמיה cytoskeletons אקטין, microtubule על הסינפסה המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ STED. שיטות אלה מוטבו באמצעות קו תא B מאתר A20, אשר ננקטה נרחב ללמוד BCR איתות, סינפסה המערכת החיסונית היווצרות17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. בגלל נוגדנים מסחרי קליפ-170 לא פעלה היטב עבור immunostaining בניסויים הקודמים, נתאר בפירוט את הביטוי של מתויג GFP קליפ-170 בתאים A20, יחד עם צביעת פרוטוקולים להמחשת בו זמנית עד ל שלושה מרכיבים cytoskeletal או חלבונים הקשורים שלד התא. שיטות לשימוש STED מיקרוסקופ כדי התמונה אקטין-NK תאים חיסוניים הסינפסות היה שתואר לעיל40. כאן, אנו להרחיב זה רכישת תמונות ברזולוציה סופר צבע רב של אקטין והן microtubule cytoskeletons בתאי B.

שיקול מכריע עבור סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה היא באמצעות ההליכים קיבוע מתאים לשמירה על מבנים הסלולר ולמניעת נזק חלבונים פלורסנט. את הקיבעון, צביעת שיטות שהוצגו במסמך זה מוטבו שומרים על ידי קרינה פלואורסצנטית GFP ולספק דימות ברזולוציה של הרשתות אקטין, microtubule. כאשר המבטאים חלבונים פלורסנט, יצוין כי בתאי B הם בדרך כלל קשה transfect. באמצעות פרוטוקול זה, 20-50% של A20 תאים בדרך כלל לבטא את חלבון כימרי transfected GFP, בקרב אוכלוסייה זו רמות החלבון הביטוי משתנה. למרות זאת, הדמיה ברזולוציה-העל של אקטין, microtubules באמצעות ההליכים שנתאר די חזקים, תמונות באיכות גבוהה מתקבלים בקלות. למרות גודלם הזעיר יחסית בתאים A20, אנו מראים כי הליכים אלה גם יכול לשמש כדי תמונה ברשת microtubule בתאי B הראשי הופעלו בקצרה עם ליפופוליסכריד (LPS). הראינו כי מופעל LPS בתאי B ראשי יכול להיות transfected עם siRNAs יעילות גבוהה יחסית (כלומר, כאלה כי חלבון דלדול ניתן להבחין באמצעות immunoblotting), גורמים להם אלטרנטיבה טובה לשימוש של שורות תאים B עבור מחקרים 17.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת קולומביה הבריטית חיה טיפול הוועדה. 1. הבעת GFP-fusion חלבונים בתאים A20 B-לימפומה התרבות התאים A20 ב להשלים RPMI בינוני (RPMI-1640 בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS), 50 מיקרומטר מרקפטואתנול, גלוטמין 2 מ מ, פירובט 1 מ מ, 50 פניצילין U/mL ו- 50 ס?…

Representative Results

עבור תאים B הפצת על קיבוע אנטי-Ig, מיקרוסקופ STED בשילוב עם תוכנת deconvolution מספק תמונות ברזולוציה גבוהה של מבנים cytoskeletal מאשר מיקרוסקופיה קונפוקלית. זה מתבטא, איור 1, שם הרשת F-אקטין היה visualized באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל. השוואה של קונאפוקלית ו STED תמונות ברזולוצ…

Discussion

תמונות מפורט של מבנים cytoskeletal יכולה להיות מושגת באמצעות מיקרוסקופ סופר רזולוציה STED, אשר באופן תיאורטי ניתן להשיג רזולוציה של 50 ננומטר, בהשוואה קונפוקלית קונבנציונאלי, אשר הינו הפתרון עקיפה-מוגבלת ~ 200 ננומטר 24. היכולת לפתור מבנים עדינה יותר בהמשך משופרת באמצעות deconvolution תוכנה ל?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים המתקן הדמיה מכון מדעי החיים UBC (LSI) תמיכה ולשמירה על המיקרוסקופ STED. עבודה זו מומן על ידי מענק #68865 מן המכון הקנדי של בריאות המחקר (M.R.G.). אנו מודים Kozo Kaibuchi ד ר (אוניברסיטת נאגויה, נגויה, יפן) על פלסמיד הקליפ-170-GFP.

Materials

Cell culture
A20 mouse B-lymphoma cells ATCC TIB-208 Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface
RPMI-1640 Thermo Fisher Scientific  R0883
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 12483020 Heat inactivate at 56 oC for 30 min
2-mercaptoethanol Millipore Sigma M3148
Glutamine Millipore Sigma G5763
Sodium pyruvate Millipore Sigma P5280
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Liquid, 10,000 units
Additional materials for primary B cells
70-µm cell strainer Corning 352350
Magnetic bead-based B cell isolation kit Stemcell Technologies 19854 EasySep Mouse B cell Isolation kit
Lipopolysaccharide (LPS) Millipore Sigma L4391 LPS from E. coli 0111:B4
B cell-activating factor (BAFF) R&D Systems 2106-BF-010
Name Company Catalog Number Comments
Transfection
Plasmid encoding CLIP-170-GFP Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Recommended transfection reagents and equipment
Amaxa Nucleofection kit V Lonza VCA-1003 Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2b Lonza AAB-1001 Program L-013 used
Falcon 6-well plates, TC treated, sterile Corning 353046
Name Company Catalog Number Comments
Coating coverslips
18-mm diameter round #1.5 cover glasses Thomas Scientific 1217N81 Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580
Forceps Fisher Scientific 1381242 Dissecting extra fine splinter forceps
Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate Corning 353043
100% methanol Fisher Scientific A412-4
Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Thermo Fisher Scientific 10010049
Goat-anti-mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 115-005-008 For A20 cells
Goat-anti-mouse IgM antibody Jackson ImmunoResearch 115-005-020 For primary mouse B cells
Name Company Catalog Number Comments
Staining
Paraformaldehyde (16% stock solution) Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute with PBS to working concentration
Glutaraldehyde (50% stock solution) Millipore Sigma 340855 Dilute with PBS to working concentration
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Saponin Millipore Sigma S2149
Bovine serum albumin (BSA), Fraction V Millipore Sigma 10735094001
Rabbit anti-tubulin antibody Abcam ab52866 1:250 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11009 1:100 dilution recommended but should be optimized
Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin Thermo Fisher Scientific A12380 1:100 dilution recommneded but should be optimized
Prolong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Without DAPI
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Parafilm VWR P1150-2
HEPES Millipore Sigma H3375
NaCl Fisher Scientific BP358
KCl Millipore Sigma P9333
CaCl2 Millipore Sigma C1016
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500
MgSO4 Fisher Scientific M63
Dextrose Fisher Scientific D16-500
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy
Leica SP8 TCS STED microscope Leica
Huygens deconvolution software Scientific Voume Imaging See https://svi.nl/HuygensProducts
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
  2. Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
  3. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
  4. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
  5. Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
  6. Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
  7. Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
  8. Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
  9. Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
  10. Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
  11. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
  12. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  13. Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  14. Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
  15. Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
  16. Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
  17. Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
  18. Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
  19. Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
  20. Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
  21. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  22. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  23. Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
  24. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
  25. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  26. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  27. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
  28. Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
  29. Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
  30. Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
  31. Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
  32. Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
  33. Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
  34. McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
  35. Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
  36. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  37. Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
  38. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  39. Yuseff, M. -. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  40. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  41. Russ, J. C. . The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).
  42. Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
  43. Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Tags

ActinMicrotubuleCytoskeletonB-cellImmune SynapseSTED MicroscopyCytoskeleton OrganizationCytoskeleton ReorganizationImmune Cell ActivationFluorophoresA20 B-lymphoma CellsTransfectionGoat Anti-mouse Immunoglobulin G AntibodyCoverslips
check_url/fr/57028?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Wang, J. C., Bolger-Munro, M., Gold, M. R. Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57028, doi:10.3791/57028 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image