Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

Jia C. Wang; Madison Bolger-Munro; Michael R. Gold

doi:10.3791/57028

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Article de méthode

Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

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DOI :

10.3791/57028

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9 avril 2018

Jia C. Wang¹ , Madison Bolger-Munro¹ , Michael R. Gold¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour microscopie STED simultanément les structures image actine, microtubules et protéines microtubule bout plus contraignantes dans les cellules de B qui se sont propagés sur lamelles recouvertes d’anticorps dirigés contre le récepteur des cellules B, un modèle pour la phase initiale de formation de la synapse immunitaire.

Résumé

Les lymphocytes B qui se lient aux antigènes membranaires (par exemple, sur la surface d’une cellule de présentatrices) forment une synapse immunitaire, une structure cellulaire spécialisée qui optimise la signalisation de cellules B récepteur (BCR) et acquisition d’antigène induite par la BCR. Le remodelage du cytosquelette d’actine et de la réorientation de la réseau de microtubules vers le site de contact de l’antigène sont essentiels pour la formation des synapses immunitaire. Remodelage du cytosquelette d’actine dans un anneau périphérique dense d’actine-F est accompagnée par la polarisation du pôle Organisation des microtubules vers la synapse immunitaire. Protéines microtubule bout plus contraignantes, ainsi que les protéines corticale plus-fin capture la médiation des interactions physiques entre l’actine et des microtubules cytosquelettes, qui leur permettent d’être réorganisé de manière coordonnée. Élucider les mécanismes que cette réorganisation du cytosquelette, mais aussi comprendre comment ces structures du cytosquelette façonner la formation des synapses immunitaire et BCR de signalisation, de contrôle peuvent apporter un nouvel éclairage sur l’activation des lymphocytes B. Cela a été favorisé par l’élaboration de méthodes de microscopie de Super-résolution qui révèlent de nouveaux détails de l’organisation en réseau du cytosquelette. Nous décrivons ici une méthode pour microscope émission stimulée épuisement (STED) simultanément les structures image actine, microtubules et plus-fin transfectées GFP-étiquetée microtubule protéines dans les cellules de B. Pour modéliser les événements précoces dans la formation des synapses immunitaire, nous laisser diffuser sur lamelles enduites d’anticorps de anti-l’immunoglobuline (anti-Ig), qui déclenchent la BCR de signalisation et de remodelage du cytosquelette des cellules B. Nous fournissons des protocoles étape par étape pour exprimer les protéines de fusion de GFP dans des cellules A20 B-lymphome, pour la diffusion cellulaire induite par l’anti-Ig et pour la fixation ultérieure de cellule, immunomarquage, acquisition d’images et image déconvolution étapes. Les images haute résolution obtenues à l’aide de ces procédures permettent de visualiser simultanément les structures de l’actine, les microtubules et les protéines de liaison de plus en bout de microtubules qui peuvent lier ces deux réseaux du cytosquelette.

Introduction

Quand les cellules B lient à polarisé tableaux d’antigènes (p. ex., affichés sur l’aire des présentatrices d’antigène cellules (CPA)), le récepteur des cellules B (BCR) qui en résulte la formation d’une structure classique de synapse immunitaire, qui a été décrit dans les disques de signalisation T les cellules¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰