Visualisera den aktin och mikrotubuli Cytoskeletons på B-cellen immun synapsen använder stimulerad Emission utarmning (STED) mikroskopi
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att använda STED mikroskopi samtidigt bilden aktin strukturer, mikrotubuli och mikrotubuli plus-end bindande proteiner i B-celler som har spridit sig på coverslips belagd med antikroppar till B-cells receptor, en modell för den inledande fasen immun synaps bildas.
Abstract
B-celler som binder till membran-bundna antigener (t.ex., på ytan av en antigen-presenterande cell) bildar en immun synaps, en specialiserad cellstruktur som optimerar B-cells receptor (BCR) signalering och BCR-medierad antigen förvärv. Både den omdaning av aktin cytoskelettet och reorientationen av det mikrotubulära nätverket mot antigen Kontakta webbplatsen är väsentliga för immun synaps bildas. Ombyggnad av aktin cytoskelettet i en tät perifera ring av F-aktin åtföljs av polarisering av mikrotubuli-organisera centrum mot immun synapsen. Mikrotubuli plus-end bindande proteiner, liksom kortikala plus-end fånga proteiner medla fysiska interaktioner mellan de aktin och mikrotubuli cytoskeletons, som tillåter dem att omorganiseras på ett samordnat sätt. Klarlägga mekanismerna att kontroll denna cytoskeletal omorganisation, samt förstå hur dessa cytoskeletal strukturer formar immun synaps bildas och BCR signalering, kan ge nya insikter i B-cellsaktivering. Detta har varit hjälpt av utvecklingen av super-resolution mikroskopi metoder som avslöjar nya Detaljer för cytoskeletal nätverk organisation. Här beskriver vi en metod för att använda stimulerad emission utarmning (STED) mikroskopi samtidigt bilden aktin strukturer, mikrotubuli och transfekterade GFP-märkta mikrotubulära plus-end bindande proteiner i B-celler. För att modellera de tidiga händelserna i immun synaps bildas, tillåter vi B-celler att sprida på coverslips belagd med anti immunglobulin (anti-Ig) antikroppar, som inleda BCR signalering och cytoskelettet remodeling. Vi tillhandahåller stegvisa protokoll för uttrycker GFP fusionsproteinerna i A20 B-lymfom celler, anti-Ig-inducerad cell spridning och för efterföljande cell fixering, immunfärgning, bild förvärv och image deconvolution steg. De högupplösta bilder som erhållits med dessa förfaranden tillåter en att samtidigt visualisera aktin strukturer, mikrotubuli och de mikrotubuli plus-end bindande proteiner som kan länka dessa två cytoskeletal nätverk.
Introduction
När B-celler binder till polariserade matriser av antigener (t.ex., visas på ytan av antigen-presenterande celler (APC)), den resulterande B-cells receptor (BCR) signalering enheter bildandet av en klassisk immun synaps struktur, som först beskrivs i T celler1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inledningsvis, kontakta microclusters av antigen-bundna bindande företagsbestämmelser form vid periferin av B cell: APC webbplats. Dessa microclusters sedan gå mot mitten av antigen kontakta platsen, där de smälter samman till en central supramolekylär aktiveringen kluster (cSMAC) som utgör kärnan i immun synapsen. Immun synaps bildas optimerar BCR signalering och underlättar BCR-medierad antigen extraktion från APC membran14. Detta antigen förvärv, som följs av BCR-medierad antigen internalisering och efterföljande antigen bearbetning, tillåter B-celler att presentera peptid: MHC II komplex att T-celler och framkalla T cell hjälp14. Eftersom immunförsvaret synaps bildas främjar B cellaktivering, klarlägga mekanismerna som fastställer detta funktionella mönster av receptorn organisation kan ge nya är insikter i hur humoralt immunsvar initierat och reglerade.
Omorganisation av både aktin och mikrotubuli cytoskeletons är viktigt för immunsystemet synaps bildas. Lokaliserade BCR signalering stimuleras av ett rumsligt-polariserade utbud av antigener inducerar snabba och dramatiska remodeling av aktin cytoskelettet1,15. Bildandet av dendritiska aktin strukturer på peripheryen av cellen B utövar driftiga styrkor på plasmamembranet och främjar B cell spridning. Detta gör den B-cellen att skanna ett större område av antigen-uthärda ytbehandlar, och ökar antalet bindande företagsbestämmelser som binder antigen och aktivera BCR signalering vägar. Samtidigt är MTOC och det mikrotubulära nätverket omorienteras mot platsen för antigen kontakt. MTOC nalkas antigen Kontakta webbplatsen, mikrotubuli som härrör från MTOC sträcker sig längs inre ansiktet av plasmamembranet på gränssnittet mellan den B-cellen och de antigen-bärande yta16,17. Dessa juxtamembrane mikrotubuli kan sedan fungera som spår för dynein-medierad centripetal förflyttning av antigen-bundna BCR microclusters18, leder till bildandet av en cSMAC.
Den omorientering och polarisering av MTOC mot immun synapsen kräver intakt aktin och mikrotubuli cytoskeletons, och beror ofta på interaktioner mellan de kortikala aktin nätverk och mikrotubuli16,17, 19,20. Kortikala aktin-bindande proteiner, såsom IQGAP1, kan fånga mikrotubuli genom att interagera med proteinkomplex som pryder det mikrotubulära plus-avslutar21. Dessa dynamiska komplex av plus-end bindningsproteiner inkluderar EB1 och klipp-170, vilka benämns kollektivt som mikrotubulära plus-end spårning proteiner (+ TIPs)21,22. + TIPs på ändarna av mikrotubuli kan binda till proteiner som är associerade med plasmamembranet eller kortikal aktin cytoskelettet. Detta tillåter kraft genererar mekanismer (t.ex., minus-slutet riktad rörelse av cortically-förankrade dynein längs mikrotubuli) att utöva dragande krafter på mikrotubuli, och därmed flytta MTOC. KLIPP-170 kan binda till proteinet aktin-associerade byggnadsställningar IQGAP123, och vi har visat att båda dessa proteiner är nödvändiga för BCR-inducerad MTOC polarisering mot immun synaps17. IQGAP1-CLIP-170 interaktionen kan spela en viktig roll i samordningen av ombyggnaden av aktin cytoskelettet med ompositioneringen av det mikrotubulära nätverket på B-cellen immun synapsen.
Konventionella fluorescensmikroskopi har visat dramatiska omorganiseringen av de aktin och mikrotubuli cytoskeletons under B-cell immun synaps bildas2. Dock inte kan denna metod lösa små cellulära strukturer i detalj på grund av diffraktionsgränsen av ljus, som enligt Abbes lag, är beroende av våglängden på ljuset används för att belysa provet och bländare på objektiv24. Detta diffraktionsgränsen begränsar upplösningen av konventionella ljus Mikroskop till 200-300 nm i lateral riktning och 500-700 nm i axiell riktning25. Därför mindre subcellulära strukturer, samt fina detaljer av de aktin och mikrotubuli cytoskeletons, kunde endast observeras med hjälp av elektronmikroskopi. Elektronmikroskopi imaging i cytoskeleton är tidsödande, kräver hårda prov fixering och förberedelse protokoll som kan förändra biologiska strukturer och är begränsad till antikroppsmedierad upptäckt. Förmåga att immunostain och samtidigt bild flera proteiner eller cellulära strukturer är en betydande fördel med fluorescensmikroskopi. Dessutom uttrycker fluorescerande fusionsproteiner i celler kan realtid imaging och är användbart när effektiva antikroppar för immunfärgning proteinet av intresse inte är tillgängliga.
Senaste tekniska framsteg i super-resolution mikroskopi har övervunnit de diffraktion begränsningarna av ljus och tillåtna visualisering av nanoskala cellulära strukturer24. En sådan super-resolution mikroskopi teknik kallas stimulerad emission utarmning (STED) mikroskopi. STED sysselsätter två lasrar, där en laser retar fluorophore och en andra laser med en donut-formade mönster selektivt dämpar fluorescens utsläpp runt fluorophore. Detta minskar funktionen point-spread (skenbara area) på en enda fluorescerande partikel och ger en sub diffraktion gränsen fluorescerande bild25,26. Grundtillståndet utarmning mikroskopi sysselsätter också fluorescens-baserad teknik för att förvärva super-upplösning bilder. Dock de bild förvärv och återuppbyggnad är lång, det finns endast ett begränsat antal fluorophores som kan användas och den samtidiga högupplöst avbildning av flera cytoskeletal komponenter tekniskt utmanande eftersom att upprätthålla aktin och mikrotubuli strukturer kräver olika fixering förfaranden. Därför STED har flera fördelar jämfört med elektronmikroskopi och andra super-resolution mikroskopi närmar sig i att den erbjuder snabb bild förvärv, har minimal efterbearbetning krav och sysselsätter den samma fluorophores och färgningsteknik som används för konventionella fluorescensmikroskopi av fasta prover26.
Super-resolution mikroskopi har nu använts för att visualisera aktin strukturer på immun synapsen i natural killer (NK) celler och T celler26,27,28,29,30, 31. super-upplösning imaging av mikrotubuli cytoskelettet, samt samordnad omorganiseringen av de aktin och mikrotubuli cytoskeletons under immun synaps bildandet, har bara nyligen dock rapporterade17. Vi brukade bild B celler som hade tillåtits att sprida på coverslips belagd med anti immunglobulin (anti-Ig) antikroppar, som stimulerar BCR signalering och initiera cytoskelettet omorganisation STED mikroskopi. När pläterade på immobiliserade anti-Ig antikroppar, genomgå B-celler dramatiska aktin-beroende fördelning, som recapitulates inledande händelserna under immun synaps bildas. Ännu viktigare, visade STED mikroskopi fina detaljer av dendritiska ringen av F-aktin som former vid periferin av immunförsvaret synaps och visade att MTOC, liksom den mitotiska fäst vid den, hade flyttat nära antigen kontakta plats17. Dessa mikrotubuli utsträckta utåt mot perifer ringen av F-aktin. Dessutom flerfärgade STED avbildning av olika kombinationer av F-aktin, tubulin, IQGAP1, och GFP-märkta CLIP-170 + TIPs visade att mikrotubulära plus-avslutar präglas av CLIP-170-GFP var nära förknippad med den perifera aktin meshwork och med IQGAP1, en kortikala fånga protein17.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för imaging de aktin och mikrotubuli cytoskeletons på immun synapsen använder STED mikroskopi. Dessa metoder har optimerats med raden murina B cell A20, som allmänt har använts för att studera BCR signalering och immun synaps bildas17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. eftersom kommersiella antikroppar till klipp-170 inte fungerade bra för immunfärgning i tidigare experiment, beskriver vi i detalj uttrycket av GFP-märkta CLIP-170 i A20 celler, tillsammans med Färgprotokoll för att visualisera samtidigt upp till tre cytoskeletal komponenter eller cytoskelettet-associerade proteiner. Metoder för att använda STED mikroskopi till bild aktin på NK cell immun synapser har varit beskrivs tidigare40. Här, utvidga vi detta till flerfärgade super-upplösning bilder av både aktin och mikrotubuli cytoskeletons i B-celler.
En kritisk fråga för super-resolution mikroskopi använder lämpliga fixering förfaranden för att upprätthålla cellulära strukturer och att förebygga skador på fluorescerande proteiner. Fixering och färgning metoder som presenteras häri har optimerats för att behålla god Jordbrukarsed fluorescens och tillhandahålla högupplösta imaging av aktin- och mikrotubuli. När uttrycker fluorescerande proteiner, bör det noteras att B-celler är oftast svåra att transfect. Användning av detta protokoll, 20-50% av A20 celler vanligtvis uttrycker de transfekterade GFP-fusionsprotein, och bland denna population nivåerna av proteinuttryck är variabel. Ändå är super-upplösning imaging aktin och mikrotubuli använder de förfaranden som vi beskriver ganska robusta och högkvalitativa bilder erhålls lätt. Trots sin storlek i förhållande till A20 celler visar vi att dessa förfaranden kan också användas till bild det mikrotubulära nätverket i primära B-celler som kort har aktiverats med lipopolysackarid (LPS). Vi har visat att LPS-aktiverat primära B-celler kan vara transfekterade med siRNAs på relativt hög verkningsgrad (dvs.sådana att protein utarmning kan upptäckas av immunoblotting), vilket gör dem ett bra alternativ till användning av B cellinjer för vissa studier 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detaljerade bilder av cytoskeletal strukturer kan erhållas med hjälp av STED super-resolution mikroskopi, som teoretiskt kan nå en lösning av 50 nm, jämfört med konventionella konfokalmikroskopi, där diffraktion begränsad upplösning är ~ 200 nm 24. förmåga att lösa finare strukturer förstärks ytterligare med hjälp av deconvolution programvara för att beräkna troligen positionen av ursprungliga ljuskällan från observerade ”suddig” fluorescens signalen. Det här protokollet b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging anläggningen för att stödja och upprätthålla mikroskopet STED. Detta arbete finansierades genom bidrag #68865 av kanadensiska institut för hälsa forskning (till M.R.G.). Vi tackar Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japan) för CLIP-170-GFP Plasmiden.
Materials
| Cell culture | |||
| A20 mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface |
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | R0883 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | |
| Glutamine | Millipore Sigma | G5763 | |
| Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P5280 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid, 10,000 units |
| Additional materials for primary B cells | |||
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| Magnetic bead-based B cell isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | EasySep Mouse B cell Isolation kit |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391 | LPS from E. coli 0111:B4 |
| B cell-activating factor (BAFF) | R&D Systems | 2106-BF-010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transfection | |||
| Plasmid encoding CLIP-170-GFP | Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002 | ||
| Recommended transfection reagents and equipment | |||
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Falcon 6-well plates, TC treated, sterile | Corning | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating coverslips | |||
| 18-mm diameter round #1.5 cover glasses | Thomas Scientific | 1217N81 | Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580 |
| Forceps | Fisher Scientific | 1381242 | Dissecting extra fine splinter forceps |
| Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate | Corning | 353043 | |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-008 | For A20 cells |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | For primary mouse B cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Staining | |||
| Paraformaldehyde (16% stock solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute with PBS to working concentration |
| Glutaraldehyde (50% stock solution) | Millipore Sigma | 340855 | Dilute with PBS to working concentration |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Saponin | Millipore Sigma | S2149 | |
| Bovine serum albumin (BSA), Fraction V | Millipore Sigma | 10735094001 | |
| Rabbit anti-tubulin antibody | Abcam | ab52866 | 1:250 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11009 | 1:100 dilution recommended but should be optimized |
| Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12380 | 1:100 dilution recommneded but should be optimized |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Without DAPI |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Parafilm | VWR | P1150-2 | |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| KCl | Millipore Sigma | P9333 | |
| CaCl2 | Millipore Sigma | C1016 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| Leica SP8 TCS STED microscope | Leica | ||
| Huygens deconvolution software | Scientific Voume Imaging | See https://svi.nl/HuygensProducts |
References
- Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).
- Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
- Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
- Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).
- Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).
- Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
- Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
- Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
- Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
- Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
- Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
- Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
- Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
- Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
- Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
- Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
- Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
- Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
- Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586 (2015).
- Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
- Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
- McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
- Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
- Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
- Yuseff, M. -. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Russ, J. C. . The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).
- Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
- Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).
